콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

본 절차의 전반적인 목표는 조직 공학 실험에 사용할 수 있는 모듈형 미세 조직을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 주사기를 사용하여 폴리에틸렌 튜브 내로 콜라겐 용액을 끌어당긴 후, 콜라겐을 겔화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 폴리에틸렌 튜브를 2 mm 길이로 잘라 미세 조직 모듈을 형성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 모듈을 튜빙에서 분리하는 것이며, 마지막으로 모듈에 혈관 내피세포를 코팅합니다. 최종적으로, 이렇게 제작된 마이크로 조직은 미세유체 챔버를 통해 세포 간의 상호작용을 연구하기 위한 인비트로(in vitro) 세포 분석에 사용할 수 있습니다. 또한, 이 마이크로 조직을 이식하여 생체 내(in vivo)에서 마이크로 조직의 상호작용 및 리모델링을 연구하기 위한 조직을 생성할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 토론토 대학교 Sepan Lab의 Brendan Long입니다. 대형 3D 조직 대체물을 제작할 때 직면하는 주요 장애물은 이식 후 신속한 혈관 형성이 부족하다는 점입니다. 이 영상에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 내피세포로 코팅된 모듈형 조직을 만드는 방법을 보여드리겠습니다.

시연은 Septin lab의 포스트닥터 펠로우인 Chamberlain이 진행하겠습니다. 중화할 콜라겐의 양은 폴리에틸렌 튜브의 길이에 따라 달라집니다. 이번 시연에서는 내경 0.76 millimeter, 외경 1.22 millimeter인 2m 길이의 폴리에틸렌 튜브를 사용하겠습니다.

튜빙을 준비하려면 20 G 바늘 하나를 튜빙의 한쪽 끝에 끼운 다음, 가스 멸균을 위해 튜빙을 컨버터 자가 치유 파우치(converter self-heal pouch)에 넣습니다. 콜라겐 1 mL가 폴리에틸렌 튜빙 약 2m를 채우므로, 콜라겐 1 mL를 중화시키겠습니다. 콜라겐을 15 mL 원추형 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

콜라겐 1mL당 10 x alpha, MEM 128 µL를 튜브에 넣고 피펫팅을 반복하여 혼합합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며, alpha MEM이 산성화된 콜라겐과 섞이면서 용액이 노란색으로 변해야 합니다. 다음으로 0.8 M 중탄산나트륨을 첨가하여 콜라겐을 중화합니다. pH를 대략적으로 추정하기 위해 노란색 콜라겐 용액이 연분홍색으로 변할 때까지 중탄산나트륨을 첨가합니다.

pH 7.4를 맞추기 위해서는 일반적으로 콜라겐 1 mL당 30~60 µL가 소요됩니다. 중화된 콜라겐이 겔화되는 것을 방지하려면 사용 직전까지 얼음 위에 보관하십시오. 콜라겐 겔화 절차를 시작하려면, 멸균된 폴리에틸렌 튜브가 들어 있는 백을 생물 안전 작업대로 옮긴 후 튜브는 백 안에 둔 상태에서 백의 밀봉된 끝부분을 잘라내십시오.

멸균된 핀셋을 사용하여 튜브의 한쪽 끝에 미리 삽입해 둔 20 gauge 바늘에 3 mL 주사기를 연결합니다. 튜브의 반대쪽 끝을 얼음 위에 보관 중인 원추형 튜브 바닥 끝까지 닿도록 중화된 콜라겐에 삽입합니다. 다음 단계는 천천히 수행해야 하며, 그렇지 않으면 콜라겐 내에 기포가 유입될 수 있습니다.

주사기 플런저를 천천히 당겨 콜라겐을 폴리에틸렌 튜브 안으로 끌어옵니다. 콜라겐이 튜브를 통해 모두 이동하면, 20 gauge 바늘을 제거하고 튜브의 양 끝을 다시 백 안에 넣습니다. 백을 테이프로 밀봉한 후, 37 °C에서 60분 동안 배양합니다.

미리 조립된 절단 장치를 사용하여 튜빙을 절단합니다. 이 절차를 시작하려면, 절단 장치 앞에 있는 멸균 트레이에 튜빙을 놓고 튜빙을 절단 장치의 배출구에 장착한 뒤, 25 mL의 혈관내피세포 배지가 들어 있는 50 mL 원추형 튜브를 준비합니다. 절단된 모듈을 수집하기 위해, 절단 장치를 2 mm 길이로 절단하도록 설정한 다음 튜빙을 절단합니다.

절단된 모듈을 50 mL 원추형 튜브에 넣고 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. 튜브에서 콜라겐 모듈을 분리하기 위해, 모듈이 들어 있는 50 mL 원추형 튜브를 중간 속도로 10초 동안 볼텍싱합니다. 모듈이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 약 5분 정도 기다립니다.

튜브 바닥에 모듈의 느슨한 펠렛이 형성되고, 튜빙은 배지 위에 층을 형성하게 됩니다. 모듈이 가라앉으면, 입구가 넓은 10 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 이를 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 15 milliliter 원추형 튜브를 볼텍싱한 후, 모듈이 다시 가라앉도록 두 번 더 반복합니다.

두 번째와 세 번째 와텍스에서 가라앉은 모듈들 또한 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 모든 모듈을 튜브에서 제거하여 한데 모은 후, 튜브 내 배지 부피를 5 milliliter로 맞춥니다. 이제 모듈에 혈관내피세포를 코팅할 준비가 되었으며, 다음 단계에서 모듈 코팅을 위한 혈관내피세포 준비 과정이 제시될 것입니다.

먼저, 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. PBS를 제거한 후, 3 mL의 trypsin EDTA를 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 7 mL의 배지에 현탁하여 15 mL 튜브로 옮깁니다.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 원추형 튜브 바닥의 packed modules 1 mL당 5 × 10⁶개의 혈관내피세포가 필요합니다. 300 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하십시오. 세포 펠렛을 5 mL의 혈관내피세포 배지에 다시 현탁하십시오.

이제 혈관 내피세포가 포함된 배지 5 mL를 모듈에 추가합니다. 모듈을 혈관 내피세포와 함께 정적 및 동적으로 배양하는데, 정적 배양의 경우 혈관 내피세포가 포함된 모듈을 반전시켜 혼합한 다음, 튜브를 똑바로 세워 37 °C에서 15분 동안 둡니다. 15분 후, 튜브를 다시 반전시켜 37 °C에서 추가로 15분 동안 배양합니다.

내피세포와 함께 모듈을 동적으로 배양하려면, 15 mL 튜브를 37 °C에서 60분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 내피세포와의 배양이 완료되면, 모듈을 조직 배양 처리가 되지 않은 플레이트로 옮겨 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 부착되지 않은 내피세포를 제거하기 위해 모듈을 신선한 배지가 담긴 새로운 조직 배양 처리되지 않은 플레이트로 옮깁니다. 내피세포가 코팅된 모듈을 세포가 모듈 표면의 100%를 덮을 때까지 37 °C에서 배양합니다.

이 과정은 보통 약 7일이 소요됩니다. 튜브에서 처음 꺼냈을 때 모듈은 원통형 모양을 띱니다. 내피세포가 코팅된 경우, 부피가 최대 50%까지 수축하여 타원형이 될 수 있으며, 광학 현미경으로 관찰했을 때 더 조밀하고 불투명해질 수 있습니다.

이 이미지들에서 모듈의 직경과 길이는 각각 d와 l로 표시되어 있습니다. 다음 이미지는 제작 당시 모듈 내에 균일하게 분포된 삽입된 Hep G2 세포를 보여줍니다. 생존 세포의 녹색으로 표시된 바와 같이 세포들은 높은 생존율을 유지했습니다.

내피세포가 합쳐져 단층을 형성했을 때 죽은 세포는 붉은색으로 나타납니다. 모듈 표면에는 면역형광법으로 확인할 수 있는 밀착 연접이 형성됩니다. VE cadherin 염색 및 물질 전달 분석 결과, 모듈이 높은 세포 밀도를 유지하면서도 대형 조직에서 흔히 발생하는 문제인 산소 전달 부족으로 인한 괴사 중심부 형성 없이 세포를 지원할 수 있음이 입증되었습니다.

본 사례에서, 전형적인 소형 모듈의 massen Tri chro 염색 결과, 제작 7일 후에도 모듈 내에 살아있는 세포가 균일하고 높게 분포되어 있음을 보여줍니다. 이와 대조적으로, 대형 모듈의 중심부에는 다수의 사멸 세포가 형성되었으며, 가장자리에만 얇은 생존 세포 층이 남아 있었습니다. 또한, 콜라겐과 미세 폴리머의 혼합물로 구성되거나 약물 방출 미세구를 포함하는 모듈도 제작되었습니다.

여기에서 h h EC 세포가 palin 콜라겐 모듈 위에 배양되었을 때, 모듈은 원통형 모양을 유지하며 콜라겐 단독 모듈에 비해 세포 부착 특성이 제한적입니다. PLGA 기반 생분해성 미세구체를 포함하는 콜라겐 모듈의 광학 현미경 이미지가 여기에 표시되어 있습니다. 여러 가지 in vitro 분석법이 모듈과 호환되는 것으로 나타났습니다.

예를 들어, 혈관 형성 분석(angiogenesis assay)에서 내피 세포가 안착된 모듈의 모세혈관 유사 구조는 지방 유래 줄기 세포와 함께 5일간 배양한 후 쉽게 검출하고 정량화할 수 있습니다. 또 다른 예로, 모듈 내 생사 분석(live dead assay)의 공초점 현미경 이미지는 살아 있는 세포는 녹색으로, 죽은 세포는 빨간색으로 염색된 모습을 보여줍니다. 마지막으로, 모듈은 미세 유체 챔버에 사용되거나 마우스 및 랫트에 이식되어 서로 다른 세포 유형 간의 상호작용과 숙주 반응에 의해 미세 조직이 어떻게 재구성되는지를 연구하는 데에도 활용되었습니다.

해당 절차에 따라 모듈을 페트리 접시나 바이오리액터 또는 미세유체 장치와 같은 다른 용기에서 배양할 수 있습니다. 이 방법은 세포 유형의 다양한 조합을 사용하거나 서로 다른 직경의 튜브를 사용하여 다양한 조직을 생성하도록 조정할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.