실험 면역 Hypophysitis의 유도를위한 마우스 뇌하수체 Immunogen의 준비

자가면역성 뇌하수체염은 뇌하수선의 비대와 하나 이상의 뇌하수체 호르몬 결핍을 특징으로 합니다. 원인이 되는 자가항원은 아직 밝혀지지 않았습니다. 본 프로토콜에서는 이 질환을 연구하는 데 사용할 마우스 뇌하수선 단백질의 준비 방법을 설명합니다.

먼저 안락사시킨 마우스로부터 뇌하수체를 분리합니다. 그 다음, 세포를 기계적으로 파쇄하여 세포질 단백질을 방출시키기 위해 뇌하수체를 균질화합니다. 균질물을 저속 원심분리로 정제한 후, 비색법인 BCA assay로 양을 측정하고 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 질을 평가합니다.

마지막으로, 수성 단백질 균질액을 오일성 면역증강제와 혼합합니다. 그 후 이 혼합물을 마우스에 주입하여 자가면역성 뇌하수체염과 유사한 마우스 모델을 생성합니다. 동반 영상에 표시된 바와 같이, 실험 동물에서 뇌하수체염을 유도하기 위한 네 가지 기술이 설명되어 있습니다.

본 논문에서 제시하는 뇌하수체 단백질 혼합 인플루엔자 보조제 주입 기술은 1960년대로 거슬러 올라가는 가장 오래된 방법입니다. 다른 접근 방식으로는 1992년 루벨라 바이러스 유래 수용성 당단백질 주입, 2002년 뇌하수체로의 아데노바이러스 정위 주입, 그리고 2010년 한 쥐 계통의 뇌하수체를 다른 쥐 계통의 신장 캡슐 아래에 이식하는 방법 등이 있었습니다. Florence의 보조제 접근 방식의 주요 장점은 오늘날 덜 침습적이고, 더 일관적이며, 무엇보다 인간의 질환과 매우 유사한 질병을 유도하는 데 더 정확하다는 점입니다.

1960년대부터 보고되어 왔음에도 불구하고, 외래 보조제 기법은 뇌하수체염 유도에 있어 낮은 효율을 보였습니다. 박사 과정 연구를 시작했을 때, 기존에 발표된 외래 보조제 프로토콜을 사용해서는 뇌하수체염의 발생률과 중증도를 낮게밖에 얻을 수 없었습니다. 하지만 EM 유제에 포함된 pitu 단백질의 양을 10배로 늘린다는 아이디어를 적용했을 때 상황은 상당히 개선되었습니다.

이 방법은 자가면역성 뇌하수체염의 병인에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 자가항원이 아직 밝혀지지 않은 다른 자가면역 질환을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 수작업 기술과 시간, 정성이 요구되는 마지막 단계인 마진(margin) 준비 과정에서 주로 어려움을 겪습니다. 따라서 적절한 에멀전이 어떻게 준비되어야 하는지를 이해하기 위해서는 시각적인 시연이 매우 중요합니다.

이 기술의 함의는 자가면역 분야를 넘어 확장됩니다. 면역화를 위한 항원 준비 방법을 익히는 것은 단클론 항체 생산이나 새로운 백신의 테스트에도 활용될 수 있습니다. 이 기술의 시연은 저희 실험실의 S Zoo heroic Ura와 Mayland al gato가 담당하겠습니다.

마우스 뇌하수체는 두개골 기저부의 접형골에 있는 터이카(terica)라고 불리는 함몰 부위에 위치한 원통형 모양의 선입니다. 이 선은 측면으로는 삼차신경에 의해, 전면으로는 시신경교차에 의해 경계가 지어집니다. 뇌하수체는 상대적으로 큰 전엽과 더 작은 중간엽 및 후엽으로 구성됩니다.

뇌하수체를 분리하려면, 가위로 안락사시킨 마우스의 머리를 절단한 다음 두개골 뒤쪽에서 앞쪽으로 평행하게 절개합니다. 뇌를 들어 올려 뒤로 젖히면 뇌하수체가 노출되는데, 이는 이등변삼각형 구조 내에서 원통형의 형태로 나타납니다. 이때 뇌하수체가 밑변, 삼차신경이 양 변, 그리고 시신경교차가 꼭짓점이 됩니다.

닫힌 핀셋 끝으로 샘 주위를 원형으로 둘러싸 주변 수막을 절개합니다. 그 다음, 미세 핀셋을 사용하여 터키안(sella turcica)에서 뇌하수체를 집어내어 드라이아이스 위에 놓인 플라스틱 튜브에 넣습니다. 1회 준비당 300개의 마우스 뇌하수체를 수집합니다.

이 수집 과정에는 약 9인시(person hours)가 소요됩니다. 수집이 완료되면 뇌하수체를 -80°C에서 보관하였다가 필요할 때 사용하십시오. 15 mL Falcon 튜브를 얼음 수조에 넣습니다.

튜브에 균질화 버퍼 250 µL를 넣습니다. 균질화 직전에 수집한 뇌하수체 100개당 마우스 뇌하수선을 버퍼에 추가합니다. 다음으로 마우스 뇌하수선과 버퍼가 들어 있는 Falcon 튜브 바닥에 직경 5 mm 제너레이터가 장착된 polytron 균질기 팁을 놓고, 최대 속도로 30초 동안 균질화합니다.

튜브를 얼음 위에 둔 상태에서 천천히 위아래로 움직여줍니다. 그 다음 균질액을 얼음 위에서 1분 동안 방치합니다. 균질화 및 냉각 단계를 두 번 더 반복합니다.

이러한 완만한 균질화 과정은 핵을 파괴하지 않으면서 세포를 깨뜨려 단백질을 방출시켜야 합니다. 핵, 파괴되지 않은 조직, 그리고 결합 조직이나 변성 단백질 복합체와 같은 불용성 물질을 침전시키기 위해 균질물을 4°C에서 약 1000 G의 저속으로 10분간 원심 분리하십시오. 이때 펠렛이 섞이지 않도록 주의하십시오.

이제 핵 후 상층액(post nuclear supernatant) 또는 PNS라고 불리는 SNA를 새로운 Falcon 튜브에 옮겨 보관하십시오. 얼음 위에 둔 PNS의 펠렛을 이전과 동일한 부피의 균질화 완충액(homogenization buffer)으로 재현탁하고, 이전과 동일하게 균질화 및 원심분리하십시오. 두 개의 PNS 샘플을 합친 후, 용액을 여러 개의 마이크로 원심분리 튜브에 분주하십시오.

마이크로 원심분리 튜브를 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. 이 단백질 조제물은 -80 °C에서 안정적이지만, 서서히 역가가 감소합니다. 따라서 조제 후 6개월 이내에 사용할 것을 권장합니다.

BCA 분석법으로 단백질 수율과 농도를 측정하기 위해 PNS의 소량 분획물을 일부 남겨둡니다. 그 다음, 평균 총 무게가 약 570 mg인 마우스 뇌하수선 300개로부터 얻은 단백질의 품질을 젤 전기영동으로 확인합니다. 뇌하수선 단백질 수율은 60 mg 또는 조직 10 mg당 단백질 1 mg으로 예상됩니다.

단백질 농도는 일반적으로 mL당 약 40 mg입니다. 여기에 제공된 예시는 마우스 10마리를 면역화하기 위한 것입니다. 각 마우스에 1 $\mu$L의 뇌하수체 단백질 1 mg이 포함된 에멀젼을 주입하는 것으로 계획하고, 준비 과정 중의 재료 손실을 고려하여 여분의 마우스 2마리 분량을 추가하여 총 12 mg의 단백질 에멀젼을 준비합니다.

냉동된 단백질 분주액을 손으로 감싸 따뜻하게 하여 빠르게 해동하는 것으로 시작하십시오. PBS를 사용하여 단백질 농도를 20 mg/mL로 조정합니다. 다음으로, 12 mg에 해당하는 600 µL의 뇌하수체 단백질 추출물을 2.5 mL Gas Tite Hamilton 주사기에 취한 후, 5 mg/mL의 열처리된 mycobacterium tuberculosis를 함유한 완전 FRONS 보조제 또는 CFA와 함께 수동으로 흔들어 재현탁하십시오.

그런 다음 CFA 600 µL를 다른 2.5 mL Hamilton 시린지에 취합니다. CFA가 채워진 시린지에 22 gauge 마이크로 유화 바늘을 장착하여 고정합니다. 플런저를 천천히 밀어 바늘 내부가 CFA로 채워지도록 합니다.

그 다음, 바늘의 다른 쪽 끝을 뇌하수체 단백질 추출물이 채워진 다른 시린지에 연결하여 고정합니다. 시린지 내부에 공기 방울이 생기지 않도록 주의하십시오. CFA 시린지의 플런저를 천천히 밀어 오일 성분을 수용성 뇌하수체 추출물 속으로 밀어 넣어 소량만 혼합되도록 합니다.

그 다음, 뇌하수체 추출물 시린지의 플런저를 밀어 CFA 시린지로 옮깁니다. 전체 내용물이 모두 섞일 때까지 이 동작을 반복하여 혼합되는 물질의 양을 점차 늘립니다. 이렇게 희백색으로 균일하게 분포된 물질이 바로 수중유 에멀젼입니다.

에멀젼이 형성되면 왕복 사이클을 최소 500회 반복하십시오. 마지막 사이클 이후 시린지에는 물과 오일이 1:1로 혼합된 에멀젼이 담기게 되며, 이때 뇌하수체 단백질 농도는 10 mg/mL가 됩니다. 이제 에멀젼을 사용할 준비가 되었습니다. 에멀젼의 품질을 테스트하려면 비커에 담긴 물에 에멀젼 한 방울을 떨어뜨려 보십시오. 에멀젼이 올바르게 제조되었다면, 방울이 표면에서 흩어지지 않고 조밀하고 단단한 상태를 유지할 것입니다.

에멀전의 품질이 낮으면 퍼지면서 더 작은 방울로 분리됩니다. 실험적 자가면역 뇌하수체염을 유도하기 위해, 준비 당일 에멀전을 SJL 마우스에 주입합니다. 이 프로토콜은 함께 제공되는 jo of vertical에 자세히 설명되어 있습니다.

뇌하수체 수집이 완료되고 기술을 숙달하면, 신속하게 얼음 위에서 작업해야 함을 유념하며 한 시간 내에 단백질 추출을 수행할 수 있습니다. 이 단계에서, 약 한 시간이 소요되는 침지액 준비 과정이 진행됩니다. 초기 혼합 단계 이후 개발 과정에서는 천천히 인내심을 가지고 작업하시기 바랍니다.

이 기술은 자가면역 분야의 연구자들이 자가반응성 림프구가 표적 장기를 인식하고 침투하는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마우스 뇌하수체에서 단백질 추출물을 준비하는 방법과 이를 Crohn's adjuvant와 혼합하여 면역원(immunogen)으로 사용할 수 있는 유화액을 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 비활성화된 건조 미크로박테리움 튜버쿨로시스(microbacterial tuberculosis)가 포함된 주사기와 complete adjuvant를 사용할 때 실수로 찔릴 경우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

따라서 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑을 착용하고 바늘을 적절하게 폐기하십시오.