Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질의 화학량론적 및 구조적 정보를 결정하는 것입니다. 살아있는 생물학적 세포인 효모 세포 내의 모든 리간드 복합체는 관심 단백질이 공여체 또는 수용체 형광 프로브에 부착되어 발현되도록 유전적으로 조작되었습니다. 공여체 프로브는 레이저에 의해 직접 여기될 수 있습니다.

수용체는 인접한 들뜬 공여체로부터의 에너지 전이를 통해서만 들뜰 수 있으므로, 세포는 펄스 근적외선 레이저 빛에 노출됩니다. 프로브에서 방출되는 형광은 투과 격자에 의해 스펙트럼 성분으로 분리되어 전자 증배 CCD 어레이 표면에 투영됩니다. 따라서 샘플의 각 위치에서 개별적인 모든 인대(ligaments)의 전체 형광 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.

검출된 형광의 스펙트럼 프로파일은 관심 단백질 간의 특이적 상호작용에 따라 달라집니다. 스캔 셀의 각 이미지 픽셀에 대해 공여체와 수용체 프로브로부터의 개별 방출량을 결정하기 위해 데이터를 분석합니다. 각 이미지 픽셀에서 에너지 전달 효율을 결정한 다음, FRET 효율에 따라 픽셀을 분류하여 히스토그램을 생성합니다.

히스토그램 해석을 통해 단백질, 복합체 크기 및 구성의 in vivo 결정을 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 위스콘신 대학교 밀워키의 Riku 연구 그룹 소속 Michael Stoneman입니다. 제 이름은 Singh입니다.

저는 위스콘신주 밀워키에 위치한 Rikus Lab 소속입니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 하나를 한 번만 완전히 스캔함으로써 세포 내 수백 개의 모든 리가먼트 복합체로부터 전체 방출 프로파일을 얻을 수 있다는 점입니다. 일반적으로 대부분의 형광 현미경 방법은 세포 내 다양한 관심 영역에서 fret 효율을 결정하기 위해 충분한 스펙트럼 정보를 축적하도록 관심 세포를 여러 번 스캔해야 합니다.

하지만 확산 생화학 반응은 이러한 관심 영역의 분자 구성을 변화시켜 이미지 스캔을 통해 얻는 정보량을 제한할 수 있습니다. 이 방법은 살아있는 세포 내 단백질 및 단백질 상호작용 연구에서 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 유해한 올리고머의 크기는 어느 정도인지, 단백질 생애 주기 중 어느 단계에서 올리고머가 형성되는지, 그리고 세포 기능에서 이 단백질 올리고머의 역할은 무엇인지와 같은 질문들이 있습니다.

분광 분해 두 광자 현미경은 관심 샘플의 여러 위치에서 여기 빔의 초점을 스캔함으로써 이미지 셀 내의 올리마 복합체에 대한 분광 정보를 수집합니다. 한 쌍의 직교 스캐닝 미러를 사용하여 레이저 빔의 초점을 샘플의 두 가지 서로 다른 방향으로 이동시킵니다. 스캐닝 미러의 움직임은 컴퓨터로 제어되며 CCD 카메라로부터의 형광 강도 데이터 추출과 동기화되어, 라인 스캔을 통해 특정 파장의 빛에 해당하는 형광 강도 공간 맵을 재구성할 수 있습니다.

X선 형광 강도의 공간 맵을 정확하게 재구성하고 각 맵에 해당하는 실제 파장을 계산하기 위해서는, 플루오레세인 용액을 사용하여 라인 스캐닝 프로토콜을 보정해야 합니다. 보정 절차를 시작하려면 공여체 태그 GFP 22의 최대 여기 파장의 2배인 800 nanometers 파장으로 여기 스펙트럼을 송신하십시오. 여기 스펙트럼을 송신하려면 카메라와 연결된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 레이저 공동 내에 위치한 프리즘을 이동시켜 그룹 속도 분산을 수정하십시오. CCD 칩에 명령을 보내 CCD 칩의 온도를 도달 가능한 최저 온도까지 낮추십시오.

암소음(dark noise)을 줄이기 위해, 형광성(fluorescein) 용액 10 µL를 현미경 슬라이드 위에 피펫팅하고 커버 슬립으로 덮어 샘플의 얇은 층이 커버 슬립과 현미경 슬라이드 사이 영역에 균일하게 분산되도록 합니다. 커버 슬립 표면에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨립니다. 이제 현미경 슬라이드를 XY, Z 이동 스테이지에 고정하고, 리니어 액추에이터를 수동으로 조정하여 광축 방향으로 슬라이드와 스테이지를 이동시킵니다. 현미경 대물렌즈가 이머전 오일 방울에 닿을 때까지 슬라이드를 이동시킨 후, CCD 어레이에 도달하는 입사광이 컴퓨터 화면에 실시간으로 표시되도록 카메라를 데이터 획득 비디오 모드로 전환합니다.

CCD 어레이에서 검출되는 배경 노이즈를 줄이기 위해 실내의 모든 주변 조명을 끕니다. 광축 방향으로 이동 스테이지를 제어하는 마이크로미터를 천천히 조절하여 시료를 레이저 빔의 초점 영역으로 이동시킵니다. 플루오레세인 시료의 초점이 맞으면, 방출 광이 CCD 어레이에 선명한 선 형태로 나타납니다.

CCD 어레이의 픽셀 강도 판독값을 컴퓨터로 다운로드합니다. 다운로드한 강도 값 행렬을 Image J에서 열고 형광 영역을 가로지르는 선을 그려 CCD 어레이 상의 위치에 따른 픽셀 강도를 측정합니다. Image J 명령어를 사용하십시오.

플로레세인 샘플의 방출 스펙트럼을 나타내는 그래프를 생성하기 위해 플롯 프로파일을 분석하십시오. 레이저의 이동을 제어하는 미러의 증분 매개변수를 조정하십시오. 샘플 내의 인접한 y 위치에서 형광 스펙트럼의 피크가 CCD 어레이의 스펙트럼 차원을 따라 정확히 1픽셀만큼 이동하도록 Y 방향으로 초점을 맞추십시오.

이를 모니터링하기 위해, 시료의 두 가지 서로 다른 Y 위치에서 플루오레세인 스펙트럼 강도를 다운로드하십시오. 그런 다음 Image J로 강도 이미지를 열고 각 형광 스펙트럼의 피크 픽셀 위치를 찾으십시오. Image J 커서를 사용하여 CCD 셔터를 열어둔 상태로 X 방향으로 시료 전체의 레이저 초점을 스캔하십시오.

스캔 라인을 따라 각 복셀에서 방출된 빛은 각 라인 스캔 끝에 있는 CCD 어레이에 입사되어야 합니다. 이 라인 스캔에서 얻은 CCD 어레이의 데이터를 저장한 다음 CCD 어레이의 픽셀을 소거하십시오. 레이저의 위치를 이동하십시오. 앞서 결정된 양만큼 Y 방향으로 초점을 맞추십시오.

그런 다음 레이저 빔을 샘플의 X 방향으로 스캔합니다. 다시 한번 CCD 셔터를 열어둔 상태로 데이터를 저장합니다. 단일 생물학적 세포의 크기보다 약 50% 더 넓은 물리적 영역이 레이저 빛에 의해 조사될 때까지 이 라인 스캔 과정을 반복합니다.

특정 라인 스캔 이미지의 행 번호와 파장 사이의 관계를 이용하여 이미지를 재구성함으로써, 서로 다른 파장에서의 다중 여기-방출 형광 강도 안면 지도를 얻어야 합니다. 특정 파장에 대한 여기-방출 형광 이미지를 얻으려면, 첫 번째 라인 스캔에서 얻은 이미지에서 해당 파장에 해당하는 행 번호를 찾으십시오. 그러면 이후 라인 스캔 이미지의 인접한 행이 형광 방출 이미지의 다음 행에 해당하게 됩니다.

해당 파장 스택에 대해 이 파장에 해당하는 모든 이미지 행을 쌓아, 해당 파장에서 시료의 XY 형광 강도 공간 맵을 얻습니다. 이 절차를 얻을 수 있는 다른 모든 파장에 대해 반복하여 시료 데이터를 수집합니다. 먼저, 형질전환된 효모 콜로니가 포함된 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다.

최소 세 종류의 형질전환 세포가 있어야 합니다. 두 종류의 형성 프로브가 모두 태그된 표적 단백질을 발현하는 세포, 공여체 형광 프로브만 태그된 단백질을 발현하는 세포, 그리고 수용체 형광 프로브만 태그된 단백질을 발현하는 세포가 그것입니다.

100 mM KCl 100 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 마이크로 파이펫 팁을 사용하여 공여체 및 수용체 형광 프로브가 모두 태깅된 단백질을 발현하는 세포 플레이트에서 효모 콜로니 3~5개를 긁어내어 100 mM KCl 용액에 접종합니다. 이 세포들 중 세포 현탁액 10 µL를 취하여 새로운 현미경 슬라이드 위에 분주합니다.

커버 슬립으로 액적을 덮고, 커버 슬립 표면에 오일을 한 방울 떨어뜨립니다. 다음으로, 레이저 빔 경로에 있는 셔터를 수동으로 닫아 레이저 광이 현미경 대물렌즈에 도달하는 것을 차단합니다. 현미경 슬라이드를 XY, Z 이동 스테이지에 고정하고, 현미경 대물렌즈가 침강 오일 방울에 닿을 때까지 슬라이드 스테이지를 광축 방향으로 이동시킵니다.

이제 광역 조명을 켜고 카메라 설정으로 이동합니다. 데이터 수집의 비디오 모드를 선택하십시오. 방출 경로에 투과 회절격자가 있어 샘플의 광역 이미지는 심하게 흐릿하게 보일 것입니다.

따라서 투과 격자 앞쪽의 광 경로에 반치폭이 좁은 밴드패스 필터를 배치하십시오. 카메라 화면으로 세포 이미지를 확인하면서 세포가 초점에 맞을 때까지 광축 방향으로 이동 스테이지를 천천히 이동시킵니다. 단일 세포가 레이저 빔 초점 위치에 오도록 스테이지를 X 또는 Y 방향으로 이동시키십시오.

광시야 조명원을 끄고 방출 경로에서 밴드패스 필터를 제거합니다. CCD 어레이로 수신되는 신호를 동시에 관찰하면서 레이저 빔의 차단을 잠시 해제합니다. 레이저 빔이 세포에 입사하는 동안 CCD 어레이에서 형광 신호가 검출되면, 해당 세포에 대해 전체 형광 데이터 획득 스캔을 수행합니다.

앞서 설명한 보정 절차에서 결정된 스캐닝 파라미터, 특히 라인 수와 y축 증분값을 동일하게 사용하는 것이 매우 중요합니다. 공여체 태그와 수용체 태그가 모두 부착된 단백질을 발현하는 다수의 세포에 대해 세포 위치 지정 및 형광 데이터 획득 과정을 반복하십시오. 두 수용체 모두 태그가 붙은 단백질을 발현하는 세포의 형광 이미지를 충분히 확보한 후, 공여체 형광 프로브만 태그된 단백질을 발현하는 세포와 수용체 형광 프로브만 태그된 단백질을 발현하는 세포 모두에 대해 전체 과정을 반복하십시오.

마지막으로, 앞서 설명한 절차를 사용하여 모든 스캔을 재구성함으로써 각 데이터 세트에 대해 분광학적으로 분해된 XY 형광 강도 공간 맵을 얻습니다. 이 세 개의 그림은 sterile to alpha factor 수용체를 발현하는 효모 세포에서 수행된 분광학적 분해 이광자 현미경 측정값으로부터 계산된 결과 공간 맵입니다. 세포의 각 위치에서 얻은 스펙트럼 방출 프로파일을 분석하여 공여체 및 수용체 신호의 2차원 맵을 얻었습니다.

형광 강도는 그 값에 따라 가색(false colors)으로 지정되었으며, 스케일은 삽입도로 표시되었습니다. 그런 다음 KDA 및 KAD 이미지를 사용하여 겉보기 FRET 효율의 2차원 맵을 계산하였으며, 방금 보여드린 세포의 겉보기 FRET 효율 맵에서 추출한 값을 사용하여 히스토그램 플롯을 작성하였습니다. 세포에서 측정된 EAPP 값은 원형으로 표시되었습니다.

빨간색 실선은 녹색 실선으로 표시된 개별 칼슘 함수들의 합을 이용하여 측정 데이터에 가장 잘 맞게 피팅한 결과를 나타냅니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 히스토그램 분석 결과, 무균 상태의 two alpha factor receptor all ligament 복합체가 생체 내에서 RBA 형태의 tetramer 구조를 취한다는 점이 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 12시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 실험을 수행하는 동안에는 여기 광원의 세기를 낮게 유지하는 것이 중요합니다. 단일 펄스에 의해 공여체가 반복적으로 여기되는 것을 방지해야 합니다.