Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

신경과학의 가장 중요한 목표 중 하나는 시냅스 형성의 초기 단계를 지시하는 분자적 신호를 이해하는 것입니다. 이에 따라 시냅스 연결성의 변화를 정량화하기 위한 객관적인 접근법을 개발하는 것이 필수적이 되었습니다. 다양한 실험 표본에서 시냅스 수를 정량화하기 위해, 배양된 뉴런이나 뇌 조직의 동결 절편 표본을 선택적 시냅스 전 및 후 마커로 염색하여 뉴런 간의 시냅스 접촉 지점을 표시합니다.

그 다음, 세포 또는 조직을 형광 현미경으로 촬영하여 두 가지 면역조직화학 마커에 해당하는 각 채널당 8비트 이미지를 획득합니다. 이미지는 puncta analyzer가 포함된 Image J 1.29를 사용하여 분석합니다. 시냅스 전 및 후 마커 간의 공국소화(colocalization) 정도를 결정하기 위해, 공국소화 지점을 이용하여 표본 내에 존재하는 시냅스의 수를 결정할 수 있습니다.

전자현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 여기서 설명하는 기술의 주된 장점은, 시냅스 분석법을 통해 시냅스 수의 정량화 및 분석을 훨씬 더 높은 처리량으로 수행할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 주요 응용 분야는 알츠하이머병, 간질 또는 자폐증과 같이 시냅스 연결성의 이상이 기저 병리의 원인으로 지목되는 임상 질환의 진단 및 치료로 확장됩니다. 또한, 이 기술은 영향을 받은 뉴런의 상호 시냅스 형성 능력에서 나타나는 결핍을 감소시키거나 개선할 수 있는 중재 방법을 식별하는 데 활용될 수 있습니다.

이 방법은 뇌 발달 연구에 유용하지만, 각 접촉 부위의 마주 보는 면을 선택적으로 표지할 수 있는 능력이 있다면, 관심 있는 다른 모델 생물체나 장기 시스템에서 세포 간 접촉 수를 연구하거나 정량화하는 데에도 적용할 수 있습니다. P5-7 동물에서 수확한 쥐 망막에서 정제된 쥐 망막 신경절 세포를 poly-D-lysine이 코팅된 유리 커버 슬립에 플레이팅하여 신경세포 배양물을 준비합니다. 24-well 플레이트에서 세포를 transfection 전까지 37 °C에서 3~5일 동안 배양합니다.

형질전환 후, 도말된 세포가 충분히 성숙하여 시냅스가 형성될 수 있도록 세포를 7~8일 동안 추가로 배양합니다. 웰에서 배양액을 제거하고, 각 웰에 미리 데운 4% para formaldehyde 500 µL를 첨가하여 7분 동안 고정합니다. 상온에서 고정을 마친 후, phosphate buffered saline으로 세포를 3회 세척합니다.

웰 내부의 세포가 절대 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 웰에서 완충액을 제거한 후에는 즉시 다음 완충액으로 교체해야 합니다. 50% normal goat serum과 0.2% Triton X 100이 포함된 블로킹 완충액을 준비하십시오.

각 웰에서 PBS를 제거한 후, 각 웰에 블로킹 버퍼 200 µL를 첨가하고 30분 동안 블로킹합니다. 실온에서 블로킹 버퍼를 제거하고 세 번 헹굽니다. 선택한 시냅스 전 및 후 항체 쌍이 포함된 90% 항체 버퍼, 10% NGS 용액으로 1차 항체 희석액을 PBS로 준비합니다.

여기에서는 시냅스 전 마커인 rabbit antis synapsin과 시냅스 후 마커인 mouse anti homer가 사용됩니다. 침전된 항체를 제거하기 위해 벤치탑 원심분리기로 최대 속도에서 5분간 1차 항체 희석액을 원심분리한 다음, 각 웰에 1차 항체 용액 200 µL를 추가합니다. 1차 용액이 마르는 것을 방지하기 위해 플레이트를 습윤 용기에 넣습니다.

1차 항체 배양 후 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 각 웰을 3회 세척합니다. 준비된 10% NGS 함유 항체 버퍼로 1:1000으로 희석한 적절한 2차 항체 200 µL를 PBS와 함께 첨가합니다.

이전과 동일하게, 2차 항체 배양 후 디쉬를 가습 챔버에 넣고 실온의 암실에서 2시간 동안 배양합니다. 각 웰을 PBS로 3~4회 세척합니다. 유리 슬라이드 위에 DPI가 포함된 vector shield 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨립니다.

그런 다음 세포가 부착된 커버글라스를 물방울 위에 뒤집어 덮어 마운팅합니다. 마지막으로 커버슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 고정합니다. 이때 매니큐어를 바르는 동안 커버슬립이 밀리거나 움직이지 않도록 주의하십시오.

이 과정은 세포를 손상시킬 수 있으므로, 슬라이드를 건조하고 어두운 곳에서 최소 30분 동안 건조하십시오. 여기서는 적절한 필터 세트와 63배 오일 침강 대물렌즈가 장착된 zeiss axio imager 형광 현미경을 사용하여 이미징을 수행합니다. 트랜스펙션되지 않은 세포가 포함된 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓으십시오.

세포핵을 시각화하기 위해 DPI 필터 세트를 사용하여, 가장 가까운 인접 세포로부터 최소 세포 직경의 2배 이상 떨어져 있는 세포들을 선택합니다. 이 단계에서 DPI를 사용하면 편향을 방지하고 세포 선택의 무작위성을 보장할 수 있습니다. 선택된 각 세포에 대해, 이번 경우에는 GFP 및 Texas Red와 같이 적절한 필터 세트를 사용하여 8비트 이미지를 획득합니다.

중첩된 의사 색상(pseudo colored) 이미지는 시냅스 전 및 후 마커가 각각 빨간색과 초록색으로 나타나야 합니다. 다음으로, 형질전환된 세포가 포함된 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 여기에서 세포들은 TD tomato 발현 벡터로 형질전환되었습니다.

이 마커를 사용하여 이전과 같이 세포를 선택하십시오. 선택된 각 세포에 대해, 이 경우 GFP, Texas Red 및 Sci five에 해당하는 적절한 필터 세트를 사용하여 8장의 pit 이미지를 획득하십시오. 중첩된 가색(pseudo colored) 이미지에서 시냅스 후 마커는 빨간색, 녹색 및 파란색으로 표시되어야 합니다.

본 과정에서는 공국소화된 시냅스 펑처(puncta)의 정량을 위해 펑처 분석기(puncture analyzer) 프로그램을 사용합니다. Puncta analyzer 플러그인은 Barry Walk가 작성하였으며, ImageJ 1.26 버전에서 요청 시 사용 가능합니다. 수집된 이미지 중 하나를 엽니다.

원형 선택 도구를 사용하여 관심 대상인 SOR의 방사형 방향으로 세포 지름의 약 1배에 해당하는 영역을 선택합니다. 관심 영역이 선택된 상태에서 플러그인 메뉴로 이동하여 puncture analyzer를 선택합니다. 나타나는 분석 옵션 창에서 Red Channel과 Green Channel을 선택하십시오. 먼저 배경을 제거하고 결과 파일을 설정하십시오.

확인을 클릭하십시오. 그런 다음 결과를 저장할 위치를 지정하십시오. 나타나는 창에서 분석을 위해 결과를 Excel로 내보낼 수 있습니다.

다음으로, rolling ball radius가 50으로 선택되었는지 확인하고 white background 옵션을 해제하십시오. 이 수정 사항은 필수 요구 사항은 아니지만, 애플리케이션 사용자들에 의해 자주 선호되는 설정입니다. 시각화를 용이하게 하기 위해 okay를 클릭하십시오.

레드 채널 이미지에 해당하는 마스크와 함께 새 창이 나타납니다. 레드 마스크가 최대한 많은 개별 천공 지점들과 잘 일치할 때까지 임계값을 조정하십시오. 노이즈가 너무 많이 발생하지 않도록 주의하며 완료를 클릭하십시오.

최소 펑추(punctu) 크기를 4 pixels로 설정하십시오. 그 외의 다른 항목은 수정하지 마십시오. 확인을 클릭하십시오.

이번에는 녹색 채널에 대해 이전 단계를 반복하십시오. 녹색 채널에 대해 이 과정을 반복하면, 플러그인은 각 채널의 puncta에 해당하는 정량화 결과와 두 채널 간의 공국소화(co-localized)된 puncta 결과를 각각 제공합니다. 여기에 제시된 시냅스 분석법은 뇌의 동결 절편뿐만 아니라 척수나 망막과 같은 다른 모든 신경계 조직에 적용할 수 있습니다.

적절한 시냅스 전 및 후 마커 쌍이 준비되어 있어야 합니다. 먼저 방혈 및 PBS 관류를 통해 안락사시킨 마우스로부터 뇌 조직을 채취하는 것으로 시작합니다. 전체 뇌를 4% paraldehyde가 포함된 PBS에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 보관한 후 다음 날 꺼냅니다.

PBS로 뇌를 세 번 헹굽니다. 30% sucrose(PBS 기반)에 뇌를 넣어 동결 보호 처리합니다.

조직은 처음에 4°C에서 떠 있을 것이며, 조직이 바닥으로 가라앉을 때까지 이 상태를 유지합니다. 이 단계가 되면 동결 보호가 완료된 것입니다. 다음으로 20% sucrose와 OCT 및 PBS를 2:1 비율로 혼합한 용액에서, 절편 제작에 원하는 방향으로 뇌를 임베딩합니다.

예를 들어, 시상면 또는 관상면입니다. 다음으로 드라이아이스가 담긴 버킷 위에 평평한 금속 표면을 놓습니다. 그 위에 임베딩된 뇌를 올려 얼립니다. 완전히 얼면 뇌를 냉동 보관용 백에 옮겨 담고, 절편 제작 전까지 최대 1년 동안 -80 °C에서 보관합니다.

크라이오스탯을 사용하여 조직을 12 to 16 micron 두께로 절편화하여 유리 슬라이드에 부착합니다. 다음으로, 슬라이드를 37 degrees Celsius 오븐에 넣어 건조시킵니다. 그 후 PBS로 3회 세척하여 잔류 OCT를 제거합니다.

파라핀 펜을 사용하여 슬라이드 주변에 소수성 장벽을 만들고, 블로킹 버퍼를 슬라이드에 첨가하며 파라핀 경계가 버퍼가 슬라이드 밖으로 흘러나가는 것을 방지합니다. 슬라이드를 PBS에 희석된 20% normal goat serum에 담가 상온에서 1시간 동안 블로킹합니다. 그 다음, 0.3% triton과 10% normal goat serum이 포함된 PBS로 희석한 1차 항체에 절편을 넣습니다.

여기서는 rabbit anti-PSD 95를 사용하여 글루탐산성 시냅스 후 구획을 라벨링하고, Guinea pig anti-vglu2를 사용하여 글루탐산성 시냅스 전 말단을 라벨링합니다. 슬라이드를 4 °C에 두고 36~60시간 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 슬라이드를 PBS에 15분씩 세 번 담가 1차 항체를 세척합니다.

이 단계 이후에는 슬라이드가 직사광선에 노출되지 않도록 주의하십시오. 0.3% triton과 10% normal goat serum이 포함된 PBS에 1:200으로 희석한 2차 항체를 처리합니다. 여기서는 goat anti Guinea pig를 사용합니다.

Alexa 488 및 goat anti rabbit Alexa 594가 사용됩니다. 암실 내 상온에서 2시간 동안 배양합니다.

슬라이드를 마운팅하기 위해 PBS에 15분씩 4회 담가 세척합니다. dappy를 사용하여 vector shield 마운팅 매질을 소량씩 떨어뜨리고 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 커버 슬립이 움직이지 않도록 매니큐어를 바릅니다.

조직 절편의 이미징은 적절한 레이저가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 수행해야 하며, 각 절편 이미지에 대해 63배 오일 침수 대물렌즈를 사용하여 총 5 µm 깊이에 걸쳐 0.33 µm 간격으로 총 15장의 연속 광학 절편을 촬영합니다. 동물당 최소 3개 이상의 절편을 이미징해야 하며, 각 실험 조건당 최소 3마리의 동물이 포함되어야 합니다. 3장의 연속된 절편 그룹으로부터 최대 강도 투사(maximum intensity projections) 영상을 생성하여, 각각 1 µm의 깊이를 나타내는 5장의 투사 영상을 얻습니다.

이들은 성상교세포가 없는 상태에서 형성된 시냅스 수를 결정하기 위해, RG Cs에 대해 설명된 것과 유사하게 수정된 ROI를 적용하여 Image J로 정량화되었습니다. 면역화학 염색은 기초 성장 배지로 처리한 분리된 rgc를 대상으로 수행되었으며, 예상대로 빨간색으로 표시된 bassoon 항체와 초록색으로 표시된 homer 항체를 사용하였습니다. 시냅스 공국소화 지점이 거의 관찰되지 않았으며, in vitro에서 분리된 RG Cs에 성상교세포 분비 분자가 시냅스 형성 수에 미치는 영향을 결정하기 위해, 염색 후 총 12일 동안 3일마다 마우스 성상교세포 조건 배지를 처리하였습니다.

이 뉴런에서는 수많은 시냅스가 확인되었으나, soon은 빨간색으로 표시되어 있습니다. Homer는 초록색으로 표시되어 있습니다. 세포질 Lee가 발현된 TD tomato로 형질전환된 분리된 RDC는 기저 성장 배지로만 처리되었습니다. 시냅스는 관찰되지 않습니다.

TD 토마토는 파란색으로, 시냅스는 빨간색으로 나타납니다. 초록색으로 표시된 포스트시냅스 마커 homer의 신호는 거의 보이지 않습니다. 동일한 세포를 쥐 성상교세포 조건화 배지로 만성 처리하면 많은 시냅스가 관찰됩니다.

여기서 TD tomato는 파란색, synapsin은 빨간색, homer는 초록색으로 표시되어 있습니다. astrocyte conditioned medium으로 처리한 후, 빨간색의 시냅스 전(pre synapse) 마커와 초록색의 시냅스 후(post-synaptic) homer 마커로 염색한 정제된 RGC가 나타나 있습니다. puncture analyzer를 사용하여 생성된 임계값 마스크는 존재하는 두 채널에 해당합니다. colocalization 지점을 식별하면 Puncta analyzer가 이러한 지점들의 그래픽 표현을 출력합니다.

puncta analyzer는 양쪽 채널에서 식별된 개별 puncta의 수와 공국소화(colocalization) 지점의 수를 나타내는 수치 출력을 제공합니다. 이 뉴런의 분석을 통해 도출된 데이터는 성상교세포 분비 분자가 시냅스 형성을 촉진하는 능력을 보여주며, 이는 여기서 시냅스 분석법으로 제시되었습니다. 이 분석법에서는 전시냅스와 후시냅스의 면역조직화학적 표지의 공국소화를 정량화하여, 중요한 성상교세포 분비 시냅스 형성 분자인 thrombospondin에 대한 뉴런 수용체의 과발현이 성상교세포 유도 시냅스 형성을 강화함을 입증하였습니다. 이 그림은 기초 성장 배지(gm) 또는 성상교세포 조건 배지로 만성 처리된 뉴런당 평균 시냅스 수를 보여줍니다.

A-C-M-A-C-M은 공벡터를 과발현하는 세포와 비교했을 때, 트롬보스폰딘 수용체를 과발현하는 망막 신경절 세포에서 시냅스 형성을 더 강력하게 촉진합니다. 마우스 상구의 시냅스 밀도를 정량화하기 위해 구획 특이적 면역조직화학 표지자를 사용하여 시냅스 전 및 후 구획을 각각 표지하였습니다. 여기에서 보여지는 바와 같이, 생후 7일(P 7)부터 P 14까지 시냅스 수가 증가하였습니다.

이는 해당 발달 기간 동안 상구(superior colliculus) 내 시냅스 수의 증가를 보여줍니다. 숙달되면, 이 프로토콜은 해리된 신경세포 배양의 경우 약 2일, 본 절차에 따라 동물로부터 채취한 뇌 절편의 경우 약 5일 만에 완료할 수 있습니다. 시냅스 수의 변화가 각각 기능적 시냅스와 초미세 구조적으로 정상인 시냅스의 변화를 모두 반영하는지 확인하기 위해 전기생리학 및 전자현미경과 같은 다른 방법들이 활용됩니다.

이 영상을 시청하고 나면, 시냅스 수를 정량화하기 위해 실험 준비물에 면역조직화학법을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 프로토콜에서는 구획 특이적 항체를 사용하여 시냅스 전 및 후 구획을 선택적으로 라벨링하는 방법을 상세히 설명합니다. 여기에서 시냅스는 이러한 각 마커로부터 얻은 신호가 공존하는 지점으로 정의합니다.