꿀벌의 코 확장 응답 클래식 컨디셔닝에 Behavioural 약리학 ( 아피스 mellifera)

이 절차의 전반적인 목표는 학습 및 기억 형성의 기저에 있는 분자 메커니즘을 연구하는 것입니다. 꿀벌의 경우, 첫 번째 단계는 벌통에서 자유롭게 비행하는 벌들을 수집하는 것입니다. 그다음으로, 벌들을 플라스틱 튜브에 고정합니다.

절차의 세 번째 단계는 고전적 조건화를 수행하는 것입니다. 학습 및 기억 형성에 미치는 영향을 연구하기 위해 조건화 전후의 특정 시점에 약물을 투여할 수 있습니다. 절차의 마지막 단계는 기억 유지 능력을 테스트하는 것입니다.

결과적으로, 약물 처리 후의 행동 변화는 꿀벌의 학습 및 기억 형성에 기여하는 분자적 기전을 밝혀낼 수 있습니다. 이 방법은 기억 형성의 분자적 기전을 규명함으로써 학습 및 기억 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 조건 형성 및 기억 회상 과정 중 자극 제시 타이밍이 매우 정확해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 급이 체계가 매우 중요합니다. 이 절차는 내 실험실의 대학원생인 cutting gearing과 Johannes faberg가 시연할 것입니다. 실험 전날 오후 2시에서 4시 사이에 UV 광투과성 플렉시글라스 피라미드를 사용하여 벌을 채집하십시오.

실험실로 돌아오면 피라미드를 바닥면에 놓고, 꼭대기 부분만 제외한 벽면을 수건으로 가려 어둡게 만듭니다. 꼭대기를 열고 입구 위에 유리 바이알을 대고 기다려 벌 한 마리가 바이알 안으로 들어가게 한 뒤 다시 닫습니다. 가을과 겨울철에 모든 벌이 유리 바이알로 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다.

벌들이 야외로 비행하지 않을 때, 벌집을 온실 내 그물망 안에 보관하며, 그물망에서 개별 벌들을 직접 포획합니다. 벌 한 마리당 유리 바이알 하나를 사용하여, 바이알을 얼음 위에서 2.5분에서 3.5분 동안 냉각시켜 벌을 고정합니다. 벌의 상태를 주의 깊게 관찰하고, 움직임이 멈추는 즉시 얼음에서 꺼냅니다.

고정된 벌을 점착 테이프를 사용하여 작은 플라스틱 튜브에 고정합니다. 벌의 머리, 가슴, 다리는 움직일 수 없어야 하지만, 배는 자유롭게 움직일 수 있도록 해야 합니다. 또한 목 부분이 압박되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

벌의 준비가 완료되면, 취급과 식별을 용이하게 하기 위해 번호가 매겨진 랙의 구멍에 튜브를 넣습니다.

튜브는 항상 동일한 굴속으로 다시 되돌려 놓습니다. 핸들링 후, 조건화 장소와 분리된 곳에서 오후 4시에서 6시 사이에 벌에게 먹이를 줍니다. 벌과 촉각을 자극하여 Proboscis extension response 또는 PER를 유도합니다.

자당 용액을 이용하여 벌이 약 4 µL의 SRA 용액 한 방울을 섭취하게 합니다. 벌의 안테나, 입틀 또는 플라스틱 튜브에 용액이 묻지 않도록 주의하십시오. 벌이 더 이상 섭취하지 않을 때까지 각각 급여합니다.

안테나가 용액에 닿았을 때 빠르고 신뢰할 수 있는 PER(확장 반응)을 보이는지 확인하십시오. 실험의 다음 날 저녁부터는 각 벌에게 자당 용액 한 방울을 네 번 급여하십시오. 높이가 약 0.5에서 1cm인 플라스틱 그릇에 수돗물을 채우십시오.

고정된 벌들이 담긴 랙을 라이사 플레이트(lysa plates)를 플랫폼으로 사용하여 볼에 넣습니다. 볼을 카드보드로 덮고 실온에서 하룻밤 동안 보관합니다. 벌들은 수집 다음 날 오전 10시경에 후각 조건화를 거칩니다.

실험 시작 30분 전입니다. 벌집 랙을 조건화 장소 근처에 두되, 벌들이 훈련받게 될 배기 파이프 입구에서는 떨어진 곳에 배치하십시오. 그다음, 후드 내에서 조건 자극제를 준비하십시오.

필터 팁을 사용하여 정향유 4 µL를 원형 필터 페이퍼 위에 피펫팅합니다. 향이 밴 필터 페이퍼를 20 mL 주사기에 넣고 플런저를 삽입합니다. 실험자에게 음향 신호를 전달할 오디오 플레이어를 설정합니다.

이를 통해 자극의 정확한 타이밍, 자극의 시작과 종료, 지속 시간 및 배치를 보장할 수 있습니다. 조건 형성 전 과정 동안 벌의 행동을 기록할 준비를 하십시오. 조건 자극의 시작과 무조건 자극의 제시 사이에 벌이 SSIS를 확장하면 양수 점수를 부여합니다.

벌의 벌어진 하악 사이의 가상선을 가로지르게 합니다. 습득 훈련을 시작하려면, 훈련시킬 벌을 선택하여 배기구 앞에 10초 동안 위치시킵니다. 이 10초 간격이 끝나기 직전에, 냄새가 포함된 시린지를 벌의 촉각으로부터 3cm 거리에 배치합니다. 시린지를 통해 공기 20mL를 밀어내어 5초 동안 냄새를 제시합니다.

3초 후, 젖은 이쑤시개에 설탕물을 묻혀 양쪽 촉각의 원위 편모 복측 부위에 접촉시켜 무조건 자극을 줍니다. 벌과 촉각 위에 용액이 묻지 않도록 주의하며, 벌이 이쑤시개를 핥게 합니다. 이러한 복합 자극은 4초 동안 지속되며, 이후 벌을 훈련 환경에서 제거하여 랙에 다시 배치합니다.

조건 자극 제시 후 13초가 지나면 한 번의 훈련 시행은 28초 동안 지속됩니다. 시행 간 간격 10분 후에 벌을 훈련 장소로 되돌려 보냅니다. 앞서 설명한 대로 세 번의 시행 중 두 번째 시행을 수행하고, 마지막 짝짓기를 수행하기 전 10분을 추가로 기다립니다.

그날의 훈련이 완료되면 랙을 다시 보울에 넣으십시오. 오후 4시에서 6시 사이에 각 벌에게 4 µL의 설탕 용액 한 방울을 네 번 급여해야 함을 기억하십시오. 앞서 시연한 바와 같이, 유지 테스트는 훈련 후 수 분에서 수 일 사이의 어떤 간격으로든 수행할 수 있습니다. 벌 랙을 조건 형성 지점 근처에 30분 동안 두어 기억력 테스트를 준비하십시오.

벌을 배기구 앞에 10초 동안 두어 테스트를 시작합니다. 조건 자극을 5초 동안 제시하고 PER의 발생 여부를 기록합니다. 해당 날의 테스트가 완료되면 랙을 다시 용기에 넣습니다.

앞서 시연한 대로, 오후 4시에서 6시 사이에 각 벌에게 4 µL의 자당 용액 한 방울을 네 번 공급해야 함을 기억하십시오. 전체 실험이 끝난 후, 분석에 포함될 벌의 안테나에 SRA 용액을 접촉시켜 벌이 여전히 구기를 뻗을 수 있는지 확인하십시오. 벌은 전체 실험 과정 동안 생존해야 하며 온전한 PER을 유지해야 합니다. 일부 연구에서는 약리학적 개입이 후각 기억에 미치는 영향을 연구하기 위해 전신 주입법을 사용합니다. 이러한 주입은 실험 설계에 따라 서로 다른 시점에 수행될 수 있습니다.

먼저, 일회용 피하 주사 바늘을 사용하여 비행근 상단의 S scootle fissure 근처 S scootin 후방 부위의 큐티클에 작은 구멍을 냅니다. 다음으로, 유리 모세관에 테스트할 용액 1 µL를 채웁니다. 모세관을 큐티클의 구멍에 삽입하고 비행근에 용액을 주입합니다.

숙련된 실험자는 30초마다 한 번씩 B를 주입할 수 있어, 주입 및 조건 형성의 타이밍을 정밀하게 조절할 수 있습니다. 여기에서는 두 가지 실험을 제시합니다. 첫 번째 실험에서는 훈련 전 생리식염수를 전신 주입하는 것이 기억 학습에 미치는 영향을 조사합니다.

본 연구에는 치료를 받지 않은 A 그룹, 1 µL의 인산염 완충 식염수를 전신 투여한 그룹, 또는 가짜 처치(sham) 그룹의 세 그룹이 있습니다. 이러한 처치는 왼쪽의 그림에 표시된 훈련 시작 30분 전에 수행되었습니다. 습득 단계 동안 조건 반응을 보인 동물의 비율은 3회의 훈련 시행에 걸쳐 증가하였으며, 그룹 간의 유의미한 차이는 없었습니다.

우측의 막대 그래프는 PBS 주입과 가짜 병변(sham lesion) 모두 기억 유지에 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. 두 번째 실험에서 훈련 24시간 후, 훈련 종료 40분 뒤에 주입을 실시하였습니다. 벌들을 식염수를 투여받는 그룹과 단백질 합성 억제제인 anisomycin 1 µL를 투여받는 그룹으로 나누었습니다. 우측의 막대 그래프는 anisomycin을 투여받은 벌들에게서 기억 유지가 뚜렷하게 감소했음을 보여줍니다. 이러한 결과는 후각 기억 형성에 있어 단백질 합성의 중요성을 강조합니다.

이 절차에 따라, 발달 이후 학습 및 기억 형성의 신경생리학적 기초는 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전기생리학적 기록을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 학습 및 기억 연구 분야의 연구자들이 꿀벌의 기억 형성 과정에서 분자 및 신경생리학적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.