에어로빅 곰팡이에 의해 제어 플랜트 조직 분해에 대한 한천 - 블럭 Microcosms

본 절차의 전반적인 목적은 목재 수분과 외생 기질이 엄격하게 제어되는 페트리 접시 마이크로코즘에 호기성 목재 분해 균류를 접종하는 것입니다. 이는 먼저 알려진 배지를 정확한 부피로 사용하여 마이크로코즘을 준비함으로써 달성됩니다. 그다음, 분해될 목재와 모든 외생 고체 기질을 기질 간의 접촉이 없도록 하여 한천 표면의 플라스틱 그리드 위에 배치합니다.

그 다음 마이크로코스모스에 테스트 곰팡이를 접종하고 배양합니다. 배양 후, 질량 손실을 측정하고 분석용 조직을 준비하기 위해 목재 블록을 수확합니다. 최종적으로 질량 손실 측정, 균사 형태 관찰, 유도결합 플라즈마 분광법과 같은 표적 원소 분석을 통해 목재의 생분해 정도와 외인성 원소 공급원의 역할을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 미네소타 대학교 생물제품 및 생물시스템 공학과의 Jonathan Schilling 박사님 연구실 소속 Brooke Jacobson입니다. 오늘은 호기성 진균에 의한 식물 조직 분해를 위한 미세환경으로 페트리 접시를 사용하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 진균의 리그노셀룰로오스 분해 메커니즘을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

리그노셀룰로오스는 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스로 구성된 식물 조직입니다. 우리가 가장 자주 연구하는 조직은 목재이며, 오거 블록 설계의 비기술적인 측면에서 발생하는 실수가 가장 흔한 실패 원인이자 연구 간 변동성의 주요 원인이 되므로, 당사의 오거 블록 설정 과정을 비디오로 공개하는 것이 유용합니다. 우리는 경험을 통해 이 절차가 고품질의 낮은 변동성 결과를 산출한다는 것을 알고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 본 실험에서는 미세생태계 내 나무 블록 상단의 헤드스페이스(headspace)를 넓히기 위해, 일반적인 페트리 접시보다 1cm 더 깊은 페트리 접시를 사용하십시오.

칼슘과 철이 없는 배지를 페트리 접시당 20 milliliters가 되도록 충분히 제조하여 마이크로코즘 준비를 시작합니다. 보충제가 첨가된 약 400 milliliters의 탈이온수가 들어 있는 500 milliliter 부피 플라스크에 agar 15 grams를 넣습니다. 미리 준비된 스탁 용액을 사용하여 혼합물에 미량 영양소를 첨가합니다.

영양분을 첨가한 후, 부피 플라스크의 500 milliliter 표시선까지 채웁니다. 그다음, 배지를 1000 milliliter 플라스크로 옮깁니다. 121 degrees Celsius, 16 PSI 조건에서 20분 동안 오토클레이브 멸균합니다.

테스트 플레이트를 처리하기 전 agri가 응고되는 것을 방지하기 위해 플라스크당 부피가 500 milliliters를 초과하지 않도록 주의하십시오. 오토클레이브 멸균 후, 응결을 최소화하기 위해 배지가 손으로 만졌을 때 식을 때까지 기다리십시오. 수분 함량 또는 mc와 같이 수분을 최소화하는 것은 이 실험에서 매우 중요합니다.

80% 이상이 조직의 무산소증을 유발합니다. 호기성 진균에 의한 부패를 제한하고 가변성을 한 번 높이십시오. 냉각하십시오. 휴대용 피펫 에이드와 10 milliliter 멸균 폴리스티렌 피펫을 사용하여 무균적으로 수행하십시오.

생물안전작업대 내에서 한천을 높게 쌓은 플레이트로 옮깁니다. 그다음 플레이트 바닥에 맞게 플라스틱 메쉬 그리드를 넉넉하게 자릅니다. 그리드를 자르고 비누와 물로 깨끗이 세척한 후, 이번 시연을 위해 메쉬 그리드를 건조 및 오토클레이브 멸균할 수 있도록 준비합니다.

남부 황소나무(Southern yellow pine, SYP)는 중요한 재목 공급원이므로 이를 사용합니다. 미국의 주거용 주택에 사용되는 비처리 재목을 준비하고, 나뭇결을 따라 단일 종방향 절단을 통해 19 by 19 millimeter 크기의 옹이가 없는 블록을 절단합니다. 이 길이를 다시 19 millimeter 정육면체 블록으로 절단합니다.

톱 대신 치즐과 망치를 사용하여 19 mm³ 블록을 결을 따라 반으로 나눕니다. 이렇게 하면 농업용 블록 마이크로코즘의 플라스틱 메쉬 바닥면에 닿는 부분은 거친 단면이 되고, 상단은 라벨을 붙일 수 있는 매끄러운 단면이 됩니다. 블록의 매끄러운 면에 연필로 라벨을 표시하고, 실험 처리구뿐만 아니라 오염 모니터링 및 오븐 건조 재료를 위한 병렬 조건화 기초 데이터 샘플로 사용할 비접종 대조군을 충족할 만큼 충분한 양의 블록을 절단합니다. 샘플을 알루미늄 유청 팬에 담아 100 °C의 컨벡션 오븐에서 48시간 동안 건조합니다.

샘플을 오븐에서 데시케이터로 옮겨 식힙니다. 샘플의 무게를 미리 측정하여 초기 오븐 건조 중량을 결정합니다. 마지막으로, 플라스틱 그리드와 나무를 포함한 샘플을 알루미늄 호일로 단단히 감싸 수분 접촉을 최소화하여 오토클레이브 준비를 마칩니다.

각 샘플을 개별적으로 포장할 필요는 없으나, 증기 노출이 적고 일정하게 유지되어야 합니다. 라벨이 부착된 샘플을 121 °C, 16 PSI에서 1시간 동안 오토클레이브합니다. 멸균된 생물안전작업대 내에서 빈 AE, 접종용 메쉬 식물 기질 외래 물질용 소스 플레이트, 네임펜, 파라폼 스트립, 핀셋 및 전이 도구를 준비합니다.

접종의 다음 단계는 오염 위험을 최소화하기 위해 배지가 담긴 페트리 접시에 항목들을 추가하는 것입니다. 전사 도구와 핀셋은 사용할 때마다 95% ethanol로 화염 멸균하십시오. 먼저, 페트리 접시에 플라스틱 메쉬를 넣습니다.

그런 다음 여기에 나무 기질을 추가합니다. 초기 수확물과 후기 수확물의 데이터를 쌍으로 맞출 수 있도록 메쉬의 길이를 따라 두 개의 나무 블록을 추가합니다. 이 블록들은 나뭇결이 균 접종원 방향을 향하도록 나란히 배치하여 추가합니다.

다음으로, 외인성 물질을 첨가합니다. 여기서는 사상균에 의한 부후에 대해 석고의 역할이 테스트되고 있습니다. 따라서 곰팡이가 나무에 도달하기 전에 이 석고 디스크와 먼저 접촉해야 합니다.

메시 상단의 각 블록과 접종 지점 사이에 석고 디스크 하나를 추가합니다. 디스크들을 서로 가깝게 유지하되, 목재 내에서 디스크끼리 접촉하지 않도록 주의하십시오. 곰팡이 접종물의 경우, 20 mL의 한천에서 2주 동안 배양한 배양물로부터 플러그를 만들기 위해 지름 7 mm의 4번 코르크 보어(cork Boer)를 사용하십시오.

이는 접종원의 부피를 조절하는 데 도움이 됩니다. 접종하지 않은 대조군의 경우, 멸균 플레이트의 플러그를 추가하는 것이 가장 좋습니다. 접종원과 외생 기질 또는 나무가 서로 접촉되지 않도록 하되, 서로 가깝게 배치하십시오.

블록당 하나의 접종 플러그를 사용하십시오. 면도칼로 자른 파라필름으로 배양 접시를 밀봉하며, 플레이트를 수평으로 유지한 상태에서 파라필름을 매끄럽고 연속적인 동작으로 감싸십시오. 마지막으로 알코올 내성 마커를 사용하여 배양 접시 뚜껑에 라벨을 붙이되, 각 기질 바로 위에 블록 번호를 기입하십시오.

석고 디스크 위에 원을 그립니다. 내용물이 흔들리는 것을 방지하고 온도 변화로 인한 응결을 최소화하기 위해 플레이트를 생물학적 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다. 여기에서 사용된 조건은 20 °C 및 암소이며, 마지막 수확을 제외하고는 무균 상태에서 시계열 수확을 수행합니다.

5주 차 수확 시점에서 처리군 전체를 제거합니다. 각 플레이트의 상단과 하단에 70% ethanol을 분사하고, 화염 멸균한 핀셋을 사용하여 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 시료를 제거합니다. 농배지 플레이트를 폐기하기 전, morph F 또는 멜론 형태에 집중하여 사진을 촬영합니다.

그 다음 처리할 블록들을 꺼냅니다. 과도한 pha는 굴려서 제거하되, 부식된 물질이 함께 소실되지 않도록 주의하십시오. 알루미늄 쟁반에서 블록들을 건조시키고, 과도한 심지 현상(wicking)이 있는지 모니터링하기 위해 대조군의 신선 중량과 건조 중량을 이용하여 질량 손실을 결정하십시오.

질량 손실 데이터는 부식 진행 정도를 측정하는 데 도움이 되며 중요한 데이터입니다. 원소 농도를 그램 중량 기준으로 계산하려면 백분율 데이터를 표준화해야 합니다. 통계 분석을 위해, 명백히 침수된 상태인 짙은 갈색 블록에 라벨을 붙여 추적하십시오.

마지막으로 배양물을 오토클레이브 가능 봉투에 넣어 폐기하며, 플라스틱 지지 망과 향후 실험에 재사용 가능한 기타 구성 요소들은 따로 보관합니다. 농업 블록 마이크로코즘 설정을 사용하면, 소나무 목재 블록이 플라스틱 망 위에 놓여 농업 접촉면보다 높게 위치하게 됩니다. 원형 Crains는 석고 표면에 직접 접촉하여 목재 블록 내부로 성장했습니다.

이 균사체는 목재와 외생 영양소원 사이의 중요한 연결 고리 역할을 합니다. 한천 또는 고체 재료 내의 이러한 외생 물질원을 제어할 수 있다는 점은 토양 블록 설계와 비교했을 때 농업용 블록(agri block) 설계가 갖는 핵심적인 장점입니다. 여기서 5주 및 15주간 소나무와 함께 농업용 블록 마이크로코즘(microcosms)에서 배양한 후, ser crain의 목재 부패 정도를 측정하는 척도로서의 평균 중량 감소 백분율을 보여줍니다.

처리는 수행되지 않았습니다. 99% 이상의 순도를 가진 석고 또는 1% 철이 첨가된 석고 배지에 5 mM 염화칼슘을 첨가하였습니다. 각 수확 시기에서 동일한 알파벳으로 표시된 막대 간에는 유의미한 차이가 없습니다. 오차 막대는 표준편차를 나타내며, 대조군인 갈색 부후 소나무 블록에서 60% 이상의 중량 감소가 관찰되었으며, 이는 50% 이상의 부후도를 목표로 하는 미국 재료 시험 협회(ASTM) 표준 기준을 충족합니다.

16주 차에 부패의 평균 변동 계수는 0.055였습니다. 낮은 변동성과 더불어 처리 효과가 관찰되었습니다. 염화칼슘 또는 순수 석고 형태로 한천에 칼슘을 첨가했을 때 균류에 의한 부패가 억제되었습니다.

흥미롭게도, 석고에 철을 첨가하면 부패 속도가 다시 회복됩니다. 이는 부패 15주 차의 5개 반복 실험군을 관찰했을 때 칼슘이 아닌 철이 결정적인 역할을 한다는 것을 시사합니다. 동일한 갈색 부후 시험 곰팡이의 경우, 원형 라민에서 균사의 색상이 mein을 나타냅니다.

처리구 간의 외부 균사 차이를 확인하기 위해 블록을 제거하고 건조시켰습니다. 그 결과 calcium-free 처리구에서는 균사가 부족함이 드러났습니다. pure calcium 처리구에서는 황변 현상이 나타났으며, iron-amended 처리구에서는 녹색의 외관이 관찰되었습니다.

대조군은 비교를 위해 접종하지 않은 블록을 나타냅니다. 흥미롭게도, 고철 배지를 사용하면 주효과가 사라집니다. 종합적으로, 이는 이 곰팡이가 칼슘이 아닌 철을 이용한다는 것을 시사합니다.

본 자료를 통해 오거 블록(auger block) 설정을 사용하여 호기성 사상균에 의한 식물 조직의 생분해를 성공적으로 테스트하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 기질들이 서로 접촉하지 않도록 유지하는 것이 중요하며, 특히 식물 조직과 오거가 닿지 않도록 주의하십시오. 또한 오거와 플레이트의 수분 함량을 최소화하고, 배양 전 각 플레이트의 내용물이 이동하지 않았는지 다시 한번 확인하십시오. 이러한 변수들을 유념한다면, 토양 블록(soil block) 설정을 사용할 때보다 부패 환경을 훨씬 더 효과적으로 제어할 수 있습니다.

연구 질문에 답하는 데 필요한 통계적 검정력을 갖춘 데이터를 생성할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.