고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

전통적으로 세포 수준의 해상도로 현미경 분석이 필요한 생물학 및 임상 연구는, 여러 실험을 병렬로 진행하면서 순차적인 시점마다 개별 샘플을 제거하여 광학 현미경으로 평가하는 방식으로 수행되어 왔습니다. 공초점, 다광자 및 제2고조파 현미경은 모두 in situ 이미징에 유용한 기술이지만, 스캐닝 레이저 시스템과 복잡한 광원을 포함하는 필수 인프라가 매우 복잡하고 고가입니다. 본 영상에서는 5,000 US 달러 미만의 기성 부품을 사용하여 단 하루 만에 고해상도 광섬유 마이크로 내시경 시스템을 구축하는 방법을 시연합니다.

이 플랫폼은 이미지 해상도, 시야각 및 작동 파장 측면에서 유연성을 제공합니다. 먼저, 광원, 광학 필터, 렌즈, 광섬유 다발 및 CCD 카메라를 수용할 수 있도록 단순한 에피 형광 현미경 프레임을 조립합니다. 그다음, CCD 카메라 상에 광섬유 다발의 확대 이미지를 형성하는 이미징 렌즈를 설치합니다.

그 다음, 시료에 형광 여기광을 제공하기 위해 조명 광학계가 포함된 LED 광원을 설치합니다. 최종적으로, 조립된 마이크로 내시경을 통해 인비트로(in vitro) 배양, 인비보(in vivo) 동물 모델 및 인체 피험자를 포함하여 형광 표지된 시료의 세포 수준 상세 정보를 실시간 이미징으로 확인합니다. 공초점 또는 다광자 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 충분히 단순하고 저렴하여, 다양한 분야의 연구자들이 빠르게 도입하고 각자의 특정 필요에 맞게 맞춤화할 수 있다는 점입니다.

여기에 설명된 고해상도 마이크로 내시경은 조립 및 응용 방식에 따라 여러 변형이 가능한 기본 구성으로 간주되어야 합니다. 특정 응용 분야를 위한 부품을 선택할 때는 형광 현미경의 형광 물질 농도, 광퇴색 조명, 강도, 카메라 감도, 게인 및 노출 시간 사이의 내재적 관계를 고려하십시오. 본 플랫폼은 프로플라빈을 형광 대비제로 사용하도록 설계되었으나, 다른 형광 염료와 함께 작동하도록 구성할 수 있습니다.

Pro flavin은 최대 흡수 및 방출 파장이 각각 445 nanometers와 515 nanometers인 밝은 핵 염색제입니다. 다른 대조제를 사용할 경우, 사용자는 마이크로 내시경 시스템을 구성하기 위해 여기, 방출 및 다이크로익 필터를 적절하게 선택해야 합니다. 먼저 6 inch 케이지 로드 2개를 1.5 inch 케이지 로드 2개에 연결하여 7.5 inch 길이의 로드 한 쌍을 만듭니다. 로드를 폴드 미러 유닛의 한 면에 나사로 고정한 다음, 1 inch 직경의 미러를 설치하십시오.

다음으로, 폴딩 미러 유닛의 반대쪽 면에 0.5 inch 로드 4개를 나사로 고정합니다. 두 개의 하단 관통 구멍을 통해 케이지 큐브를 7.5 inch 케이지 로드에 끼웁니다. 케이지 큐브의 측면에 2 inch 로드를 나사로 고정합니다.

C 마운트를 SM1 어댑터로 연결하여 카메라를 케이지 플레이트에 부착합니다. 폴딩 미러 유닛의 전면과 수평이 되도록 케이지 플레이트를 0.5 inch 케이지 로드에 고정합니다. 카메라에 광섬유 번들의 이미지를 형성할 수 있도록 직경 1 inch의 튜브 렌즈를 선택합니다.

광섬유 번들의 원인이 최소 두 개의 픽셀에 의해 샘플링될 수 있도록 렌즈의 초점 거리를 선택해야 합니다. 카메라로 이미징할 때, 렌즈를 3인치 길이의 렌즈 튜브에 삽입하고 리테이닝 링으로 렌즈를 고정하십시오. 긴 렌즈 튜브에 리테이닝 링을 조일 때는 스패너 렌치를 사용하는 것이 유용합니다.

방출 필터를 3인치 렌즈 튜브의 첫 번째 고정 링 위에 넣고, 또 다른 링을 추가하여 필터를 제자리에 고정합니다. 필터의 방향이 필터 제조사에서 명시한 기준을 충족하는지 확인하십시오. 렌즈 튜브를 CCD 카메라와 가장 가까운 케이지 큐브 측면에 나사로 고정합니다.

이 위치 또한 여기에 표시되어 있습니다. 도식에서는 렌즈와 필터가 3인치 렌즈 튜브 없이 표시되어 있음에 유의하십시오. 정확한 확인을 위해 카메라를 컴퓨터에 연결하여 화면으로 이미지를 확인하십시오.

케이지 어셈블리를 먼 곳의 물체로 향하게 하고, 물체의 이미지가 초점으로 나타날 때까지 레일을 따라 케이지 큐브를 슬라이드합니다. 드라이버를 사용하여 케이지 큐브 측면에 있는 4개의 나사를 조입니다. 이 나사들을 조이면 레일을 고정하여 큐브가 제자리에 유지됩니다.

이렇게 하면 무한 보정 대물렌즈와 결합했을 때 튜브 렌즈가 카메라에 파이버 번들의 초점이 맞은 이미지를 형성하게 됩니다. 다음으로, 다이크로익 미러를 홀더에 삽입하고 케이지 큐브 내에 45도 각도로 배치하십시오. RMS-SM1 나사산 어댑터와 조절 가능한 렌즈 튜브를 사용하여 대물렌즈를 튜브 렌즈 홀더 반대편의 케이지 큐브 면에 고정하십시오.

그 후, SMA 커넥터를 케이지 플레이트에 나사로 고정하고, 이를 대물렌즈의 작동 거리 부근의 로드에 장착합니다. 케이지 큐브의 열린 측면에 베이스 플레이트와 엔드 캡을 추가합니다. 그런 다음 LED를 케이지 플레이트에 장착하고 2인치 로드의 끝부분에 밀어 넣습니다.

0.5 inch 렌즈 튜브에 렌즈를 추가하여, 이 튜브를 케이지 큐브 측면에 나사로 고정했을 때 LED의 상이 대물렌즈의 후면 개구부를 가득 채우도록 합니다. 또한, 렌즈 튜브에 여기 필터를 추가합니다. 이 단계에서 에폭시를 사용하여 LED 드라이버로 조명 강도를 조절할 수 있습니다.

1030 µm 파이버용 SMA 커넥터를 720 µm 시야각 파이버 옵틱 번들에 연결하십시오. 파이버 옵틱 커넥터 연결에 대한 자세한 내용은 Thorlabs의 부품 번호 FN96, 광섬유의 커넥터 연결 및 연마 가이드를 참조하십시오.

SMA 커넥터 아이즈 번들을 케이지 로드(cage Rods)에 장착된 SMA 리셉터클에 나사로 고정하십시오. 번들의 원위단(distal end)을 광대역 광원(형광등으로 충분함)을 향하게 하십시오. 그런 다음 CCD 카메라에서 번들 근위면(proximal face)의 이미지를 관찰하십시오. 마지막으로 케이지 큐브의 나사를 조이거나 풀어 객관 렌즈의 위치를 조정하십시오.

파이버 번들 이미지가 초점에 맞을 때까지 개별 도파관이 명확하게 보여야 합니다. 마이크로 내시경의 공간 분해능은 파이버 번들의 원위단 팁에 마이크로 렌즈 또는 렌즈 어셈블리를 부착하여 높일 수 있습니다. 이러한 광학계는 번들 팁을 조직에 직접 배치하는 대신, 팁이 배율을 가지고 조직 표면에 이미징되도록 구성됩니다.

이를 통해 파이버 번들의 광 안내로 인해 발생하는 공간 샘플링 주파수를 높일 수 있습니다. 확대 배율의 정도는 공간 분해능의 증가와 일치하며, 동시에 시야(field of view)의 비례적인 감소를 의미합니다. 해당 응용 분야에 필요한 배율과 작동 거리(working distance)를 갖춘 GRIN 렌즈를 선택하십시오.

렌즈의 직경이 사용하려는 광섬유 번들의 직경과 일치하는지 확인하십시오. 정확한 정렬을 위해 저배율 현미경 또는 실체 현미경 아래에서 광섬유 번들과 GRIN 렌즈를 각각 별도의 3축 수동 정밀 조절 스테이지에 장착하십시오.

다음으로 렌즈 또는 번들 면에 광학 접착제를 한 방울 떨어뜨립니다. 수동 포지셔너를 사용하여 두 구성 요소가 서로 접촉하도록 합니다. 제조사가 권장하는 적정량의 UV 광선을 인터페이스에 조사하여 접착제를 경화시킵니다.

그린 렌즈와 접합 인터페이스를 보호하기 위해, 짧은 길이의 알루미늄 모세관 튜브를 사용하여 접합부를 감쌉니다. 튜브를 접합부 위로 밀어 넣고 튜브의 양 끝에 에폭시를 한 방울씩 떨어뜨려 고정하며, 열수축 튜브를 사용하여 조립을 마무리합니다. 미세 내시경 촬영을 하기 전, 세포 및 배양물을 촬영하기 위해 촬영 대상 세포나 조직에 조영제를 도포합니다.

먼저, 피펫을 사용하여 배양액을 제거합니다. 그런 다음 프로플라빈(pro flavin) 용액을 웰에 조심스럽게 피펫팅하여 첨가합니다. 최대 1분 동안 짧게 인큐베이션한 후, 피펫으로 프로플라빈 용액을 제거하여 버립니다.

웰에 신선한 PBS 용액을 넣고 제거하여 세포를 세척한 후, 안정성을 위해 x, Y, Z축의 수동 위치 조정 스테이지가 장착된 고정 장치에 광섬유 번들의 원위단을 장착합니다. 세포 또는 조직에 염료를 도포한 후 이미징을 수행하는 동안, 광섬유 번들을 샘플에 가볍게 접촉시킵니다. 카메라 제조사에서 제공하는 소프트웨어 또는 직접 개발한 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에서 광섬유 번들의 이미지를 확인합니다.

적절한 밝기의 이미지를 얻을 수 있도록 카메라의 노출 시간과 게인 설정을 조정하십시오. 올바르게 조립되었다면, 마이크로 내시경은 일관성 있는 광섬유 다발을 통해 중계되는 에피 형광 현미경으로 작동하게 됩니다. 최적의 이미징 결과를 얻기 위해서는 세 가지 핵심 조건이 충족되었는지 확인하는 데 주의를 기울여야 합니다.

먼저, 시스템의 전체 해상도를 달성하기 위해 광섬유 다발의 근위면을 디포커스 없이 CCD 카메라로 촬영해야 합니다. 여기서는 광섬유 다발의 일부를 초점이 맞지 않는 상태, 약간 맞은 상태, 그리고 잘 맞은 상태로 각각 촬영한 모습입니다. 최적의 초점은 다발 면에 대해 대물렌즈의 실제 위치를 조정하여 찾을 수 있습니다.

둘째, 광섬유 번들의 근위면 전체 직경에 걸쳐 균일하게 조명되어야 합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이는 조명 광학계를 콜리메이션 조명(collimated illumination)으로 구성함으로써 달성할 수 있습니다. 여기에 표시된 이미지는 균일한 형광 샘플을 이러한 권장 구성으로 조명했을 때 획득한 것입니다.

임계 조명 하에서의 해당 결과가 여기에 나타나 있습니다. LED의 구조가 광섬유 다발 단면에 투영되어, 실제 시료 구조 위에 이러한 원치 않는 패턴이 겹쳐져 나타나게 됩니다. 셋째, 광섬유 다발의 근위단과 원위단 모두 깨끗해야 하며 긁힘이나 깨짐이 없도록 하는 것이 중요합니다.

이 예시에서는 이미지 잔해물이 번들 면에 붙어 있으며, 파이버 주변부 5시 방향에 작은 칩 형태의 손상이 보입니다. 잔해물은 렌즈 페이퍼와 이소프로판올 또는 표준 파이버 광학 세척 도구를 사용하여 일반적인 파이버 광학 커넥터와 동일한 방식으로 세척하여 번들 면에서 제거할 수 있습니다. 1483개의 세포를 pro flavin으로 표지하였으며, 베어 파이버 번들을 샘플 위에 가볍게 놓았습니다.

2.5 x grin 렌즈를 번들 팁에 접합했을 때의 인비트로(in vitro) 이미징을 여기에서 보여주며, 이를 통해 공간 해상도의 향상과 시야각의 감소가 이루어졌습니다. 0.5 millimeter 외경의 파이버 번들을 21게이지 바늘을 통해 통과시켜 마우스 유선 지방패드 조직 내로 삽입하여 진행한 인비보(in vivo) 이미징이 이 영상에 나타나 있으며, 심장 주기로 인한 움직임과 함께 지방세포가 명확하게 관찰됩니다. 이 예시에서는 1.5 millimeter 외경의 더 큰 파이버 번들을 사용하여 건강한 성인 지원자의 구강 점막 이미징을 수행하였습니다.

모든 예시에서, pro flavin이 핵 표지 형광 대비제로 사용되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 세포 및 조직의 in C 두 형광 이미징을 위한 광섬유 마이크로 내시경을 설계하고 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.