표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

전기생리학은 배양된 인간 배아 신장 세포에서 재조합 전압 개폐 이온 통로의 활성을 연구하는 데 흔히 사용됩니다. 성공적인 기록을 위해서는 세포가 검출 가능한 충분한 수준으로 세포막에 통로를 발현해야 하며, 개별 세포를 분리할 수 있도록 세포 밀도를 충분히 낮게 도말해야 합니다. 세포 기록을 수행할 때, 이러한 발현에 필요한 28 °C에서의 장시간 배양 기간으로 인해 세포 부착력과 막 안정성이 일반적으로 저하되어 작업에 어려움을 겪는 경우가 많습니다.

본 과정에서는 이러한 문제들을 해결하기 위해 최적화된 세포 배양 및 형질전환 방법을 시연합니다. 세포를 적절한 효율로 형질전환한 후, 이온 채널이 충분히 발현될 때까지 28 °C에서 배양합니다. 그 후 형질전환된 세포를 유리 커버스립 위에 낮은 밀도로 분주하고 37 °C에서 수 시간 동안 배양하여 세포 부착과 막 안정화를 유도합니다.

적절하게 플레이팅된 세포를 EGFP 공발현과 전세포 패치 클램프(whole cell patch clamp)를 통해 확인합니다. 기록을 수행하거나 세포를 다시 28 °C에서 배양할 수 있습니다. 채널의 표면 발현을 더욱 증가시키기 위해 L CAV 1, L CAV 2 또는 L cav 3와 같은 전압 의존성 칼슘 채널을 형질전환시킨 세포에서 기록 실험을 수행한 결과, 채널이 세포에 성공적으로 형질전환 및 발현되었음을 나타냅니다.

본 실험실에서는 L CAV 3에 대한 대표적인 결과만을 제시하였으나, 인간 세포주에서의 패치 클램프 기록을 위해 발현 효율이 낮은 이온 채널 유전자의 발현을 강화하는 방법을 개발하였습니다. 기존의 방식은 먼저 커버슬립에 세포를 분할 배양하고 이온 채널 유전자를 포함하는 플라스미드 cDNA를 형질전환한 후, 전기생리학적 기록 전에 높은 효율의 이온 채널 발현을 달성하기 위해 28 °C에서 며칠 동안 배양하는 것이었습니다. 우리의 새로운 접근 방식은 기록 전 28 °C에서 필요한 배양 시간을 크게 단축시킵니다.

이제 28°C 배양 시간을 단축함으로써 세포막이 훨씬 더 안정해지고 형질전환된 세포가 커버슬립에 훨씬 더 잘 부착된다는 것을 알 수 있습니다. 이는 기록 가능한 세포 수를 증가시켜 실험 효율성을 상당히 높여줍니다. 형질전환 전, 완전히 합류(confluent)된 HEK 2 9 3 T 세포 플라스크를 1:4 비율로 새로운 25 cm² 플라스크에 분할하여 접종하고, 세포를 37°C 5% CO2 배양기에 넣습니다.

세포를 3~4시간 동안 부착시킨 후, 4시간 뒤에 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 현미경으로 세포를 관찰하여 부착 여부를 확인합니다. 세포가 더 이상 둥근 모양이 아니며 평평해지는 것을 확인하십시오. 돌기 또는 위족(pseudopodia)이 관찰됩니다.

세포의 합쳐짐(confluence) 정도가 더 낮으면 모습은 동일하지만 세포 간의 간격이 더 넓게 나타납니다. 세포가 부착되면 필요한 시약들을 혼합하여 표준 인산칼슘 transfection을 수행합니다. 플라스크당 600 microliters의 transfection 용액에 총 12 micrograms의 DNA를 준비하십시오.

여기 다양한 이온 채널의 cDNA를 P-I-R-E-S two EGFP 플라스미드에 클로닝하였습니다. 이 발현 벡터를 포유류 세포주에 형질전환하면, 이온 채널 코딩 서열의 바로 하류이자 EGFP 코딩 서열의 상류에 위치한 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site)에서 시작되는 번역을 통해, 클로닝된 삽입물과 동일한 mRNA로부터 강화 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein)이 생성됩니다. 이를 통해 EGFP 단백질을 목적 단백질에 직접 융합함으로써 발생할 수 있는 단백질 기능의 간섭 없이, 형질전환이 성공적으로 이루어진 세포를 식별할 수 있습니다.

형질전환 용액을 세포 위에 방울방울 피펫팅한 후, 플라스크를 부드럽게 흔들어 섞고 37 °C 인큐베이터에 넣어 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 형질전환 효율을 확인합니다. 형질전환이 성공적으로 이루어진 세포는 세포 전체가 녹색으로 나타나야 합니다.

형질전환이 확인되면, 따뜻한 배지 4~5 mL를 역전 플라스크에 조심스럽게 피펫팅하여 넣습니다. 세포 표면이 아래로 향하도록 플라스크를 천천히 뒤집고, 세척액이 세포 위로 부드럽게 움직이도록 플라스크를 흔들어 세포를 세척합니다. 배지를 제거하고 이 세척 과정을 반복합니다.

두 번 더 단계적으로 진행합니다. 그런 다음 플라스크에 배지 6 mL를 추가하고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 무척추동물 이온 채널의 발현은 몇 가지 어려움이 있습니다.

첫째, 이들은 종종 크기가 크기 때문에 소포체에서 번역되는 데 오랜 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한, 포유류 세포주에서 세포막으로 효율적으로 표적화되지 않을 수 있습니다. 마지막으로, 종마다 코돈 사용 빈도가 다르기 때문에, 이종 cDNA는 HEK 2 9 3 T와 같은 포유류 세포에서 흔하지 않은 코돈을 높은 빈도로 포함하고 있을 수 있으며, 이러한 어려움 중 일부를 극복해야 합니다.

세척 및 형질전환 후 37°C에서 2시간 동안 배양한 다음, 발현 기간을 연장하기 위해 플라스크를 28°C 배양기로 옮겨 2~6일 동안 배양합니다. 배양 시간은 발현시키고자 하는 각 이온 채널의 유형에 따라 경험적으로 결정해야 합니다. 28°C에서 장기간 배양하면 세포 탈착 및 막 안정성 저하가 발생할 수 있기 때문입니다.

전기생리학적 연구를 수행하기 전에 추가적인 세포 준비가 필요합니다. 먼저, 흡입 파이펫을 사용하여 형질전환된 세포에서 배지를 제거하고, 37 °C의 트립신 용액 1 mL를 플라스크에 거꾸로 넣습니다. 그런 다음 플라스크를 조심스럽게 다시 세포 표면이 아래로 향하게 하여 트립신이 세포 위로 부드럽게 흐르도록 합니다.

플라스크를 다시 뒤집어 트립신을 제거합니다. 그런 다음 250 µL의 따뜻한 트립신을 세포 위에 직접 가하고, 세포가 떨어져 나올 때까지 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다. 그동안 poly L lysine이 코팅된 커버슬립 3~8개를 60 mm 배양 접시에 넣고 따뜻한 배양액 5 mL를 추가합니다.

세포가 분리되면 피펫팅을 약 6회 반복하여 4 mL의 따뜻한 배지에 세포를 현탁합니다. 다음으로 마이크로 피펫 팁을 사용하여 커버슬립을 눌러 배양 접시 바닥에 완전히 밀착시킵니다. 그 후 현탁된 세포 250~500 µL를 첨가합니다. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

세포를 37°C에서 너무 오래 방치하면 세포 분열이 일어나고 형질전환된 플라스미드가 희석됩니다. 형질전환된 세포는 여기에 표시된 것처럼 세포들이 서로 격리될 수 있도록 충분히 낮은 밀도로 플레이팅해야 합니다. 이는 전기생리학적 기록을 용이하게 합니다.

보조 서브유닛이 필요한 세포의 경우, 전기생리학적 기록을 수행하기 전 세포를 28°C로 옮겨 3~4일 동안 추가로 배양하는 과정이 흔히 필요합니다. 보조 서브유닛이 필요하지 않은 세포의 경우, 해당 배양 과정 직후에 바로 기록을 수행할 수 있습니다.

본 실험에 사용된 전기생리학 장치는 증폭기, 전동식 이중 피펫 조작기, 에피 형광 현미경 및 관류 시스템으로 구성됩니다. 모든 장비는 진동 격리 테이블 위에 설치되었으며, 40인치 높이의 타입 2 패러데이 케이지를 통해 외부 전기 노이즈를 제한하였습니다. 전자 제어 시스템은 Digitidata 1440 및 P clamp 10.1 소프트웨어와 연동된 아날로그-디지털 변환기 인터페이스가 설치된 PC를 포함합니다.

컴퓨터 모니터 증폭기, 전동 조작기 및 밸브 링크 퍼퓨전 제어 시스템은 모두 패러데이 케이지 외부에 설치됩니다. 독립형 19인치 금속 전기 랙의 모든 전기 장비는 구리 분배기에 접지되며, 라인 절연, 일관된 접지 및 서지 억제 기능을 제공하는 의료 등급 절연 변압기에 연결됩니다. 헤드 스테이지의 마이크로 피펫 홀더에 2~5 MΩ 저항의 화염 연마된 마이크로 피펫을 장착하여 실험 준비를 합니다.

패치 피펫에 내부 용액을 채운 뒤 가볍게 튕겨 기포를 제거하고 최종적으로 헤드 스테이지에 장착합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 세포가 도말된 커버 슬립 한 장을 상온의 외부 기록 용액 3 mL가 담긴 35 mm 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다. 마이크로 피펫으로 일정량의 약물을 접시에 첨가하는 약물 실험을 수행할 때는 기록 용액의 부피를 정확하게 측정해야 합니다. 접시를 현미경 스테이지 위에 놓습니다.

그런 다음 마이크로 전극 홀더 반전지(half cell)를 3 M cesium chloride로 절반 정도 채웁니다. 이어서 기준 전극을 반전지에 삽입하고, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 접지 전극을 배스(bath)에 배치한 후 패치 피펫을 배스 용액 속으로 내립니다. 형광 모드에서 세포를 관찰하고, 양성으로 형질전환된 단일 부착성 녹색 세포가 시야 중앙에 오도록 맞춥니다.

배스 모드(bath mode)에서 패치 피펫을 세포에 가까이 가져갑니다. 컴퓨터 화면에 나타나는 square wave 트레이스를 제로(zero)로 맞춥니다. 패치 피펫의 위치를 조절하여 세포에 살짝 닿게 함으로써 화면상의 square current 트레이스가 변동하기 시작하도록 합니다.

기가옴 씰(giga ohm seal)이 형성될 때까지 연결된 시린지로 부드럽게 흡입합니다. 기가옴 씰이 형성되면 프로그램을 패치 모드(patch mode)로 전환합니다. 시린지로 빠르게 흡입 펄스를 가하여 세포막을 관통시킵니다.

그다음 셀 모드로 전환하고 앰플리파이어에서 전체 셀 파라미터를 사용하십시오. 정전 용량 과도 현상을 보정하기 위해서는 패치 내부의 세포로 세포 내 기록 용액이 투석되어 평형을 이룰 수 있도록 해야 합니다. 이 실험을 위해 작성된 전압 클램프 프로토콜을 여기에 입력하십시오.

실험자는 세포막 전압을 조절할 때 발생하는 전압 개폐성 이온 채널을 통한 이온 전류를 측정하기 위한 프로토콜을 설계하였습니다. 이 경우, 소프트웨어가 세포를 -110 mV로 유지한 다음 -70 mV로 250 milliseconds 동안 단계적으로 변화(step)시키는 IV 프로토콜을 살펴보고 있습니다. 그 후 다시 -110 mV의 유지 전위로 돌아가며, 매 단계마다 10 mV씩 증가하여 -70 mV, -60 mV 등으로 단계가 진행되며 마지막 단계는 +20 mV까지 이어집니다.

앰플리파이어의 Lowpass Bessel 필터를 사용하여 기록된 전류를 10 kilohertz에서 필터링하고, clamp X 10.1 소프트웨어를 사용하여 2 kilohertz의 샘플링 주파수로 디지털화하십시오. 누설이 10% 미만으로 최소화된 기록만 사용하십시오. 분석을 위해, HEK 2 93 T 세포를 배양하고 여기에 표시된 세 가지 L Cav 칼슘 채널을 transfection 하였습니다. 이종 이온 채널 cDNA의 성공적인 transfection 여부는 P-I-R-E-S two eeg FP 벡터에서 생성된 형광으로 확인하였습니다.

본 연구에서는 무척추동물 cav3 전압 의존성 칼슘 채널의 성공적인 발현을 보여줍니다. 세포를 트랜스펙션하지 않은 경우 칼슘 전류가 유도되지 않습니다. 반면, 트랜스펙션된 세포에 전체 세포 전압 클램프 프로토콜을 적용하면 큰 전류가 생성됩니다.

실험자는 요구 사항에 따라 다양한 전기생리학적 조건과 데이터 분석 체계를 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 실험 시점에 대해 연구자 본인의 판단을 사용하는 것이 중요합니다. 세포막에 발현되는 채널마다 효율이 다르므로, 세포의 생존력을 높이는 동시에 관심 있는 채널의 표면 발현을 극대화하기 위한 최적의 전략을 결정하는 것은 연구자의 몫입니다.

이 영상을 시청함으로써 인간 세포주를 배양하고 유지하는 방법뿐만 아니라, 전기생리학적 기록을 위해 이들 세포에 이종 이온 통로 cDNA 및 서브유닛 cDNA를 형질전환하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다.