Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석

파트 1, 서론. 안녕하세요, 제 이름은 Rafael입니다. 저는 브라질 리우데자네이루 연방대학교의 Stevens Hans 교수님 연구실에서 박사후 연구원으로 근무하고 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Ismail입니다. 저는 연구원이며 교수이기도 합니다. 이 영상에서는 안드로이드 바디(Android bodies)의 투명 절편을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.

그럼 시작하겠습니다. 두 번째 파트인 재료 및 장비입니다. 이 절차를 위해 냉동 표본용 매립제가 필요합니다.

세포 고정을 위한 4%Paraform aldehyde 용액, 동결 보호를 위한 sucrose 용액. 끝이 약간 굽은 바늘, EBS의 시각화를 위한 실체 현미경 및 쉐이커. 3부.

여기서는 인간 배아체(human embryo bodies)를 비부착 배양 플레이트에서 배양하고 있습니다. 피펫을 사용하여 모든 배아체를 최대한 가깝게 모은 후 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. EBS를 조심스럽게 수확하여 튜브로 옮깁니다.

재료의 양이 많지 않으므로 모든 ebs를 수집하는 것이 중요합니다. EBS를 데칸트한 후, 배양액을 조심스럽게 버립니다. 튜브 바닥에 펠렛이 보여야 합니다. 이제 고정 절차를 진행할 수 있습니다.

EBS는 PBS 또는 인산염 완충 식염수 내의 4% Paraform aldehyde 용액에서 고정됩니다. 펠렛을 PFA 용액으로 재부유시키는 것이 중요합니다. 그 후 EBS를 고정액에서 30분 동안 고정합니다.

고정 후, PFA 용액을 조심스럽게 제거합니다. EBS가 다시 부유되는 것을 방지하면서 PBS 내 10% sucrose 용액으로 교체하여 EBS의 동결 보호(cryo protection)를 시작하고, 시료를 이 용액에 30분 동안 둡니다. 다음으로, 10% sucrose 용액을 조심스럽게 제거하고 EBS를 20% sucrose 용액에 다시 부유시킵니다.

다시 한번, EBS를 이 용액에 30분 동안 둡니다. 마지막으로, 20% sucrose 용액을 제거하고 PBS에 조제된 30% sucrose 용액으로 교체하여 30분 더 둡니다. 이제 EBS의 배향 및 블로킹 단계를 진행할 수 있습니다.

본 실험실에서는 빈 캡슐 껍질을 몰드로 사용합니다. EBS를 블로킹하기 위해서는 EBS를 수집하기 전에 팁의 내부 벽면을 수크로스 용액으로 코팅하는 것이 중요합니다. 이제 EBS를 조심스럽게 수집하고 팁 바닥으로 가라앉을 때까지 기다립니다.

다음으로, EBS를 블록의 중앙에 배치합니다. 이것이 블록 내 EBS의 최종 위치가 되어야 합니다. 실체 현미경과 미세 팁을 사용하여, 가능한 한 많은 설탕 용액을 수집하여 배출합니다.

ebs가 수집되지 않도록 항상 주의합니다. 끝이 약간 굽은 바늘을 사용하여 모든 EBS를 블록 중앙에 위치시킵니다. 마지막으로, 거름종이를 이용하여 남은 sucrose 용액을 수집합니다.

양질의 절편을 얻기 위해서는 블록 내 EBS의 정확한 위치가 매우 중요합니다. 다음은 쉘 내부의 EBS 위치 설정이 잘못된 예시입니다. EBS를 위치시키고 자당 용액을 제거한 후, EBS가 다시 부유되지 않도록 주의하면서 가장자리부터 쉘 내부를 OCT로 채웁니다.

남은 기포는 피펫을 사용하여 제거하고, 껍질을 15분 동안 교반합니다. 교반 후, OCT 블록을 드라이아이스에 넣어 동결시킵니다.

이 단계에서 블록을 알루미늄 호일로 감싸 -80 °C에 보관하여 추후 분석에 사용하거나, 크라이오스탯(cryostat)의 네 번째 단계인 절편 제작 과정으로 진행할 수 있습니다. 동결 절편을 만들기 위해서는 일회용 또는 영구형 블레이드, OCT 화합물, 그리고 poly L lysine으로 전처리된 유리 슬라이드가 필요합니다. OCT 블록을 냉동고에서 꺼내어 온도가 -20 °C에 도달할 때까지 크라이오스탯 내부에 보관합니다.

그 후 블록을 스탠드 위에 놓고 블레이드의 가장자리와 평행하게 맞춥니다. EB 샘플은 대부분의 다른 조직 샘플보다 훨씬 작으므로, 재료 손실을 최소화하기 위해 블록의 전체 표면이 블레이드에 동시에 닿도록 하는 것이 매우 중요합니다. 위치를 잡은 후, 블록을 10 µm 두께의 절편으로 자르고 이를 유리 슬라이드 위에 직접 수집합니다.

슬라이드는 가급적 -70 °C에서 보관하거나 당일에 바로 사용할 수 있습니다. 해당 시료는 면역조직화학 염색 또는 면역형광 염색을 진행할 수 있습니다. 결론. 본 방법은 인간 H9 또는 마우스 US P1 줄기세포 라인에서 발달한 배아 몸체의 얇은 cryostat 절편을 얻기 위한 합리적으로 저렴하고 따라 하기 쉬운 프로토콜을 제공합니다.

결과물인 동결 절편은 단백질 발현이나 EB 형태를 분석하기 위한 다양한 절차에 사용될 수 있습니다.