고도의 연결을 강화 문화의 생성을위한 두피 조직 블록의 Cryopreservation

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 신경생물학 및 행동학과의 Horney Lu 박사님 연구실 소속 Alan입니다. 그리고 저는 Bob입니다. 오늘 Lu 박사님께서는 고품질의 일차 뉴런 배양을 위한 피질 조직 블록의 일상적인 저온 보존을 위한 빠르고 효율적이며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 보여주실 예정입니다.

그럼 시작하겠습니다. 세척하고 절단한 조직을 10% TMSO 동결 배지가 들어 있는 cryo vial에 넣습니다.

동결 보존 튜브를 냉동 용기에 담아 -80 °C에서 최소 4시간 동안 보관합니다. 이후 동결된 튜브를 액체 질소에 넣어 장기 보관합니다. AC 배양을 위해 동결 보존 튜브를 온수 배스에서 해동하고, 따뜻한 HBSS로 세척하여 남아 있는 DMSO를 제거합니다.

해리를 위해 tryin d ns와 함께 신선한 HBSS를 첨가한 후, 10% EBS가 포함된 DMM을 첨가합니다. 해리 효소 활성을 중단시키기 위해 세포를 원심 분리하고, 펠렛을 10% EBS가 포함된 신선한 DMM에 재현탁하여 미리 polylysine 코팅된 디시에 도말합니다. 24시간 후, DMM을 보충된 neuro basal medium으로 교체하고 10일 동안 배양합니다.

본 프로토콜에서는 사용 전 피질 조직을 절단하기 위해 강철 면도날을 사용합니다. 면도날은 70% ethanol에서 최소 2시간 동안 멸균해야 합니다. 10 x 스톡 용액을 멸균수로 희석하여 1 x Hank's buffered salt solution HBSS를 제조하며, 제조된 1 x HBSS는 조직 처리 전까지 얼음 위 또는 4°C에서 보관합니다.

디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulf oxide) 또는 DMSO는 동결 보존제로 동결 배지에 사용됩니다. 본 프로토콜에서는 10% v/v 농도로 희석된 DMSO를 사용하며, 1X-HBSS-DMSO 혼합물을 4°C에서 보관하기 전에 완전히 혼합해야 합니다. 샘플의 동결 속도를 조절하기 위해 Nalgene 동결 컨테이너를 사용합니다.

동결 용기에 미리 라벨을 붙인 2.5 milliliter 크라이오 바이알을 넣습니다. 동결 용기가 여러 개인 경우 용기 자체에 라벨을 붙이고, 바이알에 해당 용기를 표시하는 것이 좋습니다. 이전에 냉각해 둔 10% DMSO, 동결 배지 및 동결 용기를 멸균된 생물 안전 작업대(biological safety cabinet) 내부로 옮깁니다.

여기에 1 mL의 동결 배지를 각 동결 튜브에 천천히 첨가합니다. 캡이 확실하게 닫혔는지 확인한 후, 조직 처리 직전에 튜브가 담긴 동결 용기를 4 °C에서 최소 2시간 동안 보관하십시오. 이전에 멸균한 면도날은 철저히 헹궈야 합니다. 3분 간격으로 총 3회 세척하십시오.

잔류 에탄올을 제거하는 데는 멸균수를 사용하는 것으로 충분합니다. 면도날은 멸균수에 오래 담가두면 산화되기 쉬우므로, 세척 과정은 신속하게 진행해야 합니다. 세척 전 조직은 아이스팩 위에 놓아두어야 합니다.

부유 잔해물을 제거하기 위해 차가운 one X-H-B-S-S로 가볍게 헹굽니다. 멸균된 바늘을 사용하여 조직 조각에 남아 있는 막과 혈관을 제거합니다. 세척하는 동안 조직의 구조적 무결성이 유지되도록 주의해야 합니다.

이렇게 처리함에 따라, 세척된 조직을 절단하는 효율은 생조직을 절단할 때와 눈에 띄게 다를 것이며, 대부분의 막이나 혈관이 제거되어 있어야 합니다. 조직을 세척하고 헹군 후 절단을 시작할 수 있습니다. 조직을 약 1mm³ 크기의 블록으로 깨끗하게 절단하는 것이 중요합니다.

블록의 크기가 너무 크면 해동 시 세포 회수율이 낮아집니다. 반면, 블록의 크기가 너무 작을 경우 과도한 처리가 일어날 수 있으므로 이를 피해야 합니다. 분쇄된 조직은 자동 피펫을 사용하여 일부 냉각된 one X-H-B-S-S와 함께 수집할 수 있습니다.

수집된 모든 조직을 회수하기 위해 디쉬를 HBSS로 헹구십시오. 그런 다음 조직을 대량의 1X HBSS에 넣고 바닥으로 가라앉게 하여 느슨한 펠렛(pellet)을 형성합니다. 이렇게 하면 조직이 HBSS 내에서 가라앉는 동안 남아 있을 수 있는 잔해물을 제거할 수 있습니다. 조직을 분배하기 전에 미리 냉각해 둔 냉동 컨테이너와 크라이오 튜브(cryo vials)를 준비하십시오.

조직 충전 과정을 빠르게 진행하기 위해 모든 바이알의 캡을 열어 두십시오. 실온에서 DMSO에 노출되는 시간은 10분 이내로 제한해야 합니다. 모든 조직을 사용할 때까지 한 번에 하나의 냉동 용기씩 작업하는 것이 좋습니다.

조직 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록 주의하면서 펠릿에 최대한 가깝게 상층액을 흡입하기 시작하십시오. 그런 다음 피펫에 200 µL 넓은 구경 팁을 장착하십시오. 더 작은 구경의 팁을 사용하면 조직 블록 펠릿 바닥으로 내려가는 블록의 구조가 손상될 수 있으므로 사용하지 마십시오.

조직 200 µL를 천천히 수집합니다. 이 조직을 cryo vial에 넣고 모든 vial이 채워질 때까지 다음 과정을 반복합니다. 10분 규칙이 필요할 수 있습니다.

급속 냉동 용기를 담은 cryo vial을 -80 °C 냉동고에 최소 4시간 동안 또는 시간이 부족한 경우 하룻밤 동안 보관하십시오. 충분한 시간이 지난 후, 냉동고에서 급속 냉동 용기를 꺼내 cryo vial을 가능한 한 빨리 cryo box에 배분하십시오. 장기 보관을 위해 cryo box를 액체 질소 보관함 랙에 넣으십시오.

액체 질소에서 크라이오 튜브를 가능한 한 빨리 꺼내어 크라이오 박스가 실온에 노출되는 시간을 최소화하십시오. 37°C 항온수조에 담가 샘플을 빠르게 해동하되, 이때 캡 부분은 항상 수면 위에 유지하십시오. 주기적으로 확인하며 작은 얼음 결정이 보일 때까지 해동하십시오.

세이프티 캐비닛(safety cabinet)에 넣기 전, 크라이오 튜브(cryo vile)를 70% ethanol로 멸균합니다. 만약 조직이 크라이오 튜브 벽면에 붙어 있다면, 충분한 양의 따뜻한 1X HBSS를 추가하여 해동된 조직을 회수하십시오. HBSS를 사용하여 조심스럽게 수집합니다.

모든 조직을 수집한 후, 튜브를 3~4회 뒤집어 조직이 바닥에 가라앉도록 합니다. 이 단계는 DMSO가 충분히 희석되도록 하기 위한 것입니다.

조직이 가라앉으면 상층액을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 여기에 따뜻한 1X HBSS 10 milliliters를 추가합니다. 이어서 0.25% trypsin 300 microliters와 DNase 50 microliters를 추가합니다.

조직을 가볍게 흔들어 해리시키며, 조직이 해리된 후 흐릿한 세포 현탁액이 생성되도록 합니다. 따뜻한 DMEM에 10% 강화 소 혈청(enriched bovine serum)을 추가하여 효소 활성을 중단시킨 후, 세포 현탁액을 1200 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 신선한 DMEM 및 10% EBS로 재현탁하고 폴리라이신(polylysine) 코팅 플레이트에 분주합니다.

세포가 디쉬에 부착되도록 30분 동안 둡니다. 그 다음 배지를 10% EBS가 첨가된 신선한 DM으로 교체합니다. 24시간 후, DM 함유 배지를 N2 및 B27이 보충된 neuro basal media로 교체하고 10일 동안 배양합니다.

우리는 대뇌 피질 조직 블록의 일상적인 저온 보존을 위한 광범위하고 효율적이며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 상세히 설명하였습니다. 모쪼록 좋은 결과 있으시길 바랍니다.