칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

안녕하세요, 제 이름은 Ken Paradiso입니다. 저는 Bethesda 캠퍼스에 위치한 NIH의 국립 신경질환 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Intramural 프로그램에서 Ling Gang Wu 교수님과 함께 연구하고 있습니다. 지금부터 calyx-held presynaptic recording 패치 클램핑 기술을 보여드리겠습니다.

뇌 조직을 준비하기 위해, 쥐로부터 뇌를 적출합니다. 적출한 뇌를 얼음처럼 차가운 저칼슘 용액에 넣으며, 이때 뇌에 항상 산소가 공급될 수 있도록 카보젠(carbogen)을 계속해서 버블링해 줍니다. 또한 손상을 최소화하기 위해 용액의 온도를 매우 낮게 유지해야 합니다.

이제 뇌는 이 용액에 담겨 있을 것입니다. 뇌를 꺼내어 블록에 고정할 수 있도록 적절하게 절단한 후, Sano correlate 또는 순간접착제를 사용하여 블록에 장착합니다. 그런 다음 챔버를 얼음처럼 차가운 저칼슘 용액으로 채우고, 버블링을 수행한 뒤 바이브레이토메이터 위에 올립니다. 이후 두께 180 to 190 µm로 슬라이스를 절단하며, 이때 블레이드 주파수는 70 Hz, 전진 속도는 0.01 to 0.02 mm/s로 설정합니다. 이는 초당 10 to 20 µm에 해당하는 속도입니다.

각 슬라이스를 제작한 후, 얼음처럼 차가운 식염수에서 일반 칼슘 용액이 들어 있는 이 챔버로 슬라이스를 옮깁니다. 이 용액은 기록 시 사용하는 것과 동일하며 37°C의 생리적 온도로 유지됩니다. 그런 다음 회복을 위해 슬라이스를 이곳에 둡니다.

생리학 실험을 수행하기 전, 여기에 30분에서 1시간 동안 보관합니다. 이제 뇌를 용액에서 꺼내겠습니다. 시연을 위해 더 큰 뇌를 준비했습니다.

이것은 P 20 쥐의 뇌입니다. 이를 뒤집어 보겠습니다. 우리가 관심을 가지고 있는 부분은 뇌줄기입니다.

따라서 이 아래쪽 영역과 꽃받침(calyx)이 유지된 곳이 바로 여기 이 부근입니다. 이제 나머지 뇌 부분을 절단하여 뇌줄기를 분리한 다음, 슬라이싱 챔버(slicing chamber)에서 사용할 수 있도록 뇌줄기를 준비하겠습니다. 좋습니다, 이제 뇌줄기만 분리하기 위해 나머지 뇌 부분을 잘라내겠습니다.

현재 위치를 보여드리기 위해 뒤집겠습니다. 보통은 이런 방식으로 하지 않으며, 다시 말씀드리지만 이 부분 전체를 그냥 제거해도 됩니다. 다시 원래대로 뒤집으면 뇌줄기가 분리되었으며, 바로 그 지점에서 한 번 더 절개하겠습니다.

좋습니다, 다 되었습니다. 이것이 뇌줄기입니다. Calyx of Held는 바로 여기와 저기에 위치합니다.

이것은 뇌줄기입니다. 다시 한번, 이를 약간 뒤로 밀어내겠습니다. 소뇌의 한쪽 면을 절제하면 뇌줄기를 이와 같이 옆으로 눕힐 수 있습니다.

Sano 아크릴 접착제를 소량 도포한 후, 이를 옆으로 눕힌 상태에서 차가운 얼음과 저칼슘 용액을 빠르게 채웁니다. 가능한 한 빨리 산소 라인을 삽입하십시오. 이제 이를 들어 올려 바이브레이터로 옮깁니다.

뇌의 시작 부분에 빠르게 진입한 다음, 시작 부분에 도달하면 속도를 0.01 millimeters per second로 낮춥니다. 즉, 초당 10 micros로 이동하는 것이며, 이는 매우 느린 속도로 이동하는 것입니다.

뇌의 첫 번째 부분은 mtb, 즉 trapezoid body의 medial nucleus가 있는 부분입니다. 그리고 그 부분에는, 자, 이제 transfer pipette에 넣었으므로 가능한 한 pipette 끝에 가깝게 가져가겠습니다. 여기에 뇌 슬라이스가 있으며, 이를 정상 수준의 calcium과 더 높은 온도가 유지되는 표준 기록 용액이 담긴 이 chamber로 빠르게 옮깁니다.

이렇게 하면 절편들이 슬라이싱 과정 이후에 회복되어 생리학 실험을 위한 준비 상태가 됩니다. 이제부터는 동일한 과정이 반복될 것입니다. 패치 클램핑을 수행하는 데 사용할 장비는 다음과 같습니다.

저희는 고정 스테이지 정립 현미경을 보유하고 있습니다. 말씀드린 대로 스테이지가 고정되어 있으므로, 매니퓰레이터를 통해 현미경이 그 아래에서 이동합니다. 스테이지를 고정하기 위해 wigs 및 Newman 마이크로 매니퓰레이터를 사용하며, 앰플리파이어의 헤드 스테이지로는 heca사의 EPC 10 패치 클램프 앰플리파이어를 사용합니다.

또한 언급해야 할 점은 저희가 적외선을 이용한 DIC를 사용한다는 것입니다. 여기에 IR 카메라가 있어, CAE를 찾을 때 보이는 모든 것이 화면에 표시됩니다. 패치 클램프 증폭기는 Heka 사의 Pulse라는 소프트웨어로 제어하며, 이 소프트웨어를 통해 증폭기와 모든 생리학 실험을 제어합니다.

결과가 이 화면에 나타납니다. 사용된 calyx는 커다란 시냅스 전 단말이며, 크기가 크기 때문에 단말에 물리적으로 패치(patch)를 적용할 수 있습니다. 따라서 시냅스 전 기록을 수행할 수 있으며, 이는 특히 중추신경계(CNS)에서 매우 독특한 방식입니다.

이를 통해 시냅스 전단에서 활성화된 칼슘 채널을 측정할 수 있습니다. 또한, 칼릭스로 이어지는 신경을 자극하고자 한다면 활동 전위 활성도 측정할 수 있습니다. 본 실험에서 우리가 수행하는 것은 신경전달물질을 포함하는 소포가 막과 융합하는 과정인 엑소사이토시스(exocytosis)를 측정하는 것입니다.

이제 이 소포들이 엑소사이토시스(exocytosis)라고 불리는 과정을 통해 막과 융합하면, 시냅스 말단에 막이 추가되며 이를 커패시턴스(capacitance)의 변화로 측정할 수 있습니다. 막이 말단에 추가됨에 따라 커패시턴스가 증가하게 됩니다. 따라서 오늘 제가 보여드릴 실험은 막이 제거되는 시냅스 전 단계의 커패시턴스 측정입니다. 막을 계속해서 추가할 수는 없으므로, 당연히 일부를 제거해야 합니다.

그 과정은 내세포작용(endocytosis) 또는 막 흡수라고 불립니다. 우리는 이것 또한 측정할 수 있으며, 이는 정전용량 수치의 감소로 측정됩니다. 이에 대한 예시는 나중에 보여드리겠습니다. 이제 이를 통해 칼슘 채널 활성을 모니터링하고, 외세포작용(exocytosis) 및 내세포작용에 관여하는 일부 단백질을 모니터링하여 연구할 수 있습니다.

엑소사이토시스(exocytosis) 또는 엔도사이토시스(endocytosis)에 관여하는 단백질을 차단하기 위해 펩타이드와 같은 물질을 투입할 수 있습니다. 동일한 기능을 하는 독소를 사용할 수도 있습니다. 또한 말단으로 유입되는 칼슘의 양을 조절함으로써, 엑소사이토시스 과정과 신경전달물질의 방출, 그리고 그 사건 이후에 이어지는 막의 흡수 과정을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

이 튜브에는 세포 내 기록 용액이 들어 있습니다. 이 용액은 미리 준비하여 냉동 보관하며, 일반적으로 새로운 용액을 만들기 전까지 수주에서 한 달 동안 사용할 수 있습니다. 다시 한번 말씀드리지만, 기록을 수행하기 직전에 확인해야 합니다. 튜브 내부로 일정량의 먼지 입자나 다른 종류의 이물질이 들어갈 수 있기 때문입니다.

두 가지 방법 중 하나를 선택할 수 있습니다. 용액을 꺼내어 여과하거나, 1~2분 동안 원심분리한 후 상층액만 취하여 잔해와 기타 물질이 포함된 하단 부분을 남기는 방법입니다. 저는 원심분리하는 방법을 선호하며, 지금 바로 그렇게 하겠습니다.

세포 내 용액이 들어 있는 튜브입니다. 해동된 상태이며, 소형 원심분리기를 이용하여 약 2~3분 동안 원심분리합니다. 이렇게 하면 용액 내의 커다란 먼지 입자들을 제거하기에 충분할 것입니다.

이제 방금 원심분리한 상층액을 흔들리지 않게 주의하며 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 이때 상층액의 약 90%만 옮기며, 마지막 남은 소량의 용액은 섞이지 않도록 주의하며 그 직전까지만 옮기겠습니다.

실험 동안 차가운 상태를 유지하기 위해 이것을 즉시 얼음에 올려둡니다. 이는 매우 중요한 과정입니다. 이것은 저희가 사용하는 피펫 중 하나입니다.

우리는 이를 세포 내 기록에 사용합니다. 외경 2 mm, 내경 1.16 mm의 두꺼운 벽을 가진 보어 실리카 유리 파이펫입니다. 먼저, 파이펫 내부를 역으로 채우는 작업을 수행합니다.

흡입을 적용하여 피펫을 기록 용액에 넣고 흡입함으로써, 다른 방법으로는 채울 수 없는 피펫의 아주 미세한 끝부분을 채웁니다. 이 작업이 완료되면 모세관 튜브를 사용하여 피펫 뒷부분을 통해 전극의 나머지 부분을 채웁니다. 이는 표준적인 생리학 기법으로, 말 그대로 가볍게 퉁겨서 채우는 방식입니다.

피펫 끝부분이 파손될 위험이 있지만, 그렇게 하지 않으면 공기 방울이 자주 생기게 됩니다. 이제 이를 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 피펫 홀더에 장착합니다. 그곳에는 염화은 와이어가 있습니다.

염화은 선이 세포 내 용액과 접촉하면 시냅스 전 단자의 전기적 활성을 측정할 수 있습니다. 따라서 우리는 CAE가 많이 포함된 절편을 찾으며, CAE의 밀도가 높은 상태를 유지하고자 합니다.

이제 우리는 MNTB라고 불리는 외측 상올리브핵의 내측핵을 찾고 있으며, 이곳에서 calyx app을 형성하는 말단이 발견됩니다. 따라서 우리는 슬라이스를 스캔하기 시작합니다. 예를 들어, 여기 표면에서 약간 깊은 곳에 calyx가 있지만 부착할 부분이 많지 않으므로 계속해서 가로질러 스캔합니다.

여기 우리가 목표로 하는 꽃받침이 있습니다. 화면에 두 개의 표시를 해두었는데, 이곳이 피펫이 들어갈 위치입니다. 피펫이 내려오게 될 꽃받침 부위를 확인하실 수 있습니다.

양압을 가해 꽃받침(calyx) 쪽으로 밀어 올린 다음, 양압을 해제하겠습니다. 그러면 꽃받침이 피펫 쪽으로 밀착되며, 이때 매우 약하게 흡입하여 막을 빨아올리거나 밀어내어 막이 피펫 팁에 밀봉되도록 합니다. 좋습니다, 양압을 해제했습니다.

이제 흡입을 적용하겠습니다. 여기서는 5 mV 펄스, 정확히는 4 mV 펄스를 적용하고 있습니다. 좋습니다. 됐습니다.

이제 막 전위를 -80mV로 낮추어 빠르게 변하는 과도 현상을 제거합니다. 이제 전체 세포(whole cell) 모드로 전환하겠습니다. 조심스럽게 흡입력을 가해 전체 세포 기록 상태로 진입하겠습니다.

이러한 충전 과도 현상은 피펫과 세포가 이제 연결되었으며, 전체 기록이 가능해졌음을 나타냅니다. 아주 잘 찍힌 화면이네요. 여기서 더 밝은 빨간색 선은 커패시턴스 트레이스이며, 갑작스러운 도약 후 감소하는 것을 확인할 수 있습니다.

지금까지 calyx upheld presynaptic terminal에서 기록을 얻는 기본적인 기술들을 보여드렸습니다. 또한 medial nucleus of the trapezoid body가 포함된 절편을 제작하는 방법도 설명해 드렸는데, 이곳에서 calyxes have held를 찾으실 수 있을 것입니다.

지금까지 슬라이스를 살펴보는 기술들을 보여드렸습니다. 각 슬라이스를 하나씩 확인하며 표면에 caly가 가장 많이 존재하는 슬라이스를 찾으십시오. 그런 다음 찾을 수 있는 가장 큰 caly 막을 찾아 패치 클램프 기록을 수행하십시오.

또한 패치 클램프 기록법을 보여드렸으며, 이는 표준 패치 클램프 기록 기술입니다.