달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

본 실험 절차의 전반적인 목표는 내유모세포 구심성 시냅스에서 시냅스 후 활성을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 머리가 제거된 쥐에서 최근에 적출한 달팽이관의 감각 상피를 노출시킵니다. 절차의 두 번째 단계는 절제된 정단부를 변형된 커버슬립 위에 배치하고 이를 기록 챔버로 옮기는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 기록 전극이 달린 구심성 바톤(afferent baton)의 위치를 찾고 이에 접근하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 구심성 섬유 막에 단단한 밀봉(tight seal)을 형성한 후 이를 파열시켜 패치 클램프 기법의 홀셀(whole cell) 구성을 확립하는 것입니다. 최종적으로, 홀셀 패치 클램프 전기생리학을 통해 단일 리본 시냅스(ribbon synapse)로부터의 시냅스 후 발생 또는 전위를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

와우 조직의 박리와 준비 과정은 습득하기 어렵고, 작은 구심성 섬유를 인식하고 접근하기가 쉽지 않기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 박리를 시작하기 전에, 기록하는 동안 표본을 고정할 수 있도록 수정된 커버슬립을 준비하십시오. 8~12 mm 직경의 원형 유리 커버슬립을 사용하여, 커버슬립의 가장자리 방향으로 반경화된 Sylgard를 한 방울 도포합니다.

가느다란 곤충 핀의 두꺼운 끝부분을 커버 슬립 위에 놓습니다. 곤충 핀을 유리판에 단단히 고정합니다. 핀셋을 사용하여 실 가드(sill guard)를 가열된 코일에 대고 가열하여 고정시킵니다.

동봉된 텍스트에 설명된 대로 10~20개의 미세 전극을 준비합니다. 마이크로 포지로 화염 연마(fire polishing)를 마친 후, 미세 전극의 끝단 외경은 약 1 µm가 되어야 합니다. 3주 된 쥐를 마취 및 참수 처리한 후, 피펫 벽의 최종 두께는 약 1/3 µm가 됩니다.

피부를 제거하여 해부를 시작하고, 머리를 절개하여 뇌를 제거합니다. 측두골을 노출시키기 위해 양측의 측두골을 모두 제거합니다. 각각의 측두골을 표준 세포외 용액이 담긴 깨끗한 해부 접시에 넣습니다. 다음 단계는 달팽이관을 노출시키기 위해 측두골을 감싸고 있는 뼈를 제거하는 것입니다.

포셉을 사용하여 측두골의 기저부를 단단히 잡습니다. 정원창과 난원창, 그리고 와우를 확인합니다. 난원창과 와우의 나선형 측면이 위를 향하도록 와우의 방향을 잡습니다.

와우 주변의 과도한 뼈를 제거합니다. 보조 미세 핀셋을 사용하여 와우에서 직접 뼈를 떼어내는데, 다른 부분보다 더 투명하게 보이는 영역부터 시작하십시오. 이 부분은 뼈가 더 얇아 제거하기가 더 쉽습니다.

정단부 코일 주변의 뼈를 계속해서 제거합니다. 미세 해부 가위를 사용하여 정단부 회전 아래의 modis를 절개합니다. 그런 다음 정단부 회전을 와우의 하단 회전부와 분리합니다.

정단 코일을 보호하는 데 주의하십시오. 코일이 당겨지거나 늘어나서는 안 됩니다. 마지막으로, 조직이 너무 많이 찢어지지 않도록 주의하며 와우에서 정단 회전 부위를 제거하십시오.

미세 핀셋을 사용하여 남은 뼈를 제거합니다. 다음 단계는 oculis의 STR과 tial 막을 제거하는 것입니다. 모세포 영역 바깥쪽에 위치한 반짝이는 조직 띠인 oculis의 STR을 조심스럽게 제거하십시오.

oculis의 STR과 함께 쉽게 떨어져 나갈 수 있는 감각 모세포가 제거되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 미세 핀셋을 사용하여 tial 막을 분리하십시오. 감각 모세포 위에 위치한 빛나고 반투명한 막입니다. 이제 과도한 조직과 뼈를 다듬고 핀셋으로 표본을 평평하게 펴십시오.

이는 조직을 핀 아래에 고르게 배치하기 위해 필요합니다. 이제 해부가 완료되었습니다. 해부를 마친 후, 핀이 유모세포에서 떨어진 위치에 오도록 주의하며 준비된 커버슬립 위의 핀 아래에 표본을 배치하십시오.

포셉을 사용하여 준비물을 기록 챔버로 옮기되, 와우 조직을 고정하는 커버슬립 위에 세포외액 한 방울을 유지하고 즉시 세포외 용액으로 관류를 시작합니다. 준비물의 생존율을 높이기 위해 현미경의 10배 대물렌즈 또는 40배 수침 DIC 대물렌즈를 사용하십시오. 준비물의 위치를 잡기 위해, 기록 전극이 내유모세포의 측벽에 직각으로 접근할 수 있도록 준비물의 방향을 맞춥니다.

프레파라션이 말려 있어 내유모세포 기저부의 가시성이 제한되는 경우, 기록 전극을 사용하여 프레파라션의 외측 가장자리를 유리 커버슬립 방향으로 눌러주십시오. 이때 내유모세포 자체를 누르지 않도록 주의하십시오. 본 프레파라션에서는 상단 전극이 프레파라션의 외측 가장자리를 누르고 있으며, 하단 전극은 구심성 신경 말단(afferent batons)이 위치한 지점을 표시하고 있습니다.

참고로, NC 70 Nuv Con 카메라는 모니터에 확대된 Forex 이미지를 표시하여 내유모세포 영역의 조직이 건강한지 평가하는 데 사용됩니다. 기준점으로 모발다발(hair bundles)을 찾고 초점을 아래로 맞추어 핵을 찾으십시오. 구심성 말단이 있는 내유모세포의 기저부 쪽으로 더 깊게 초점을 맞춘 다음, 모니터상에서 핵의 높이에 도달할 때까지 다시 초점을 올리십시오.

이제 내유모세포 기저부 주변의 구심성 바톤(afferent batons)을 찾으십시오. 바톤은 구형 또는 타원형으로 지름이 약 1 µm이며, 색상이 밝고 광택이 납니다. 초점을 위아래로 조절하며 찾으실 수 있습니다.

다음 단계는 세포 내 용액이 채워진 1 µm 팁의 기록 전극을 사용하여 구심성 섬유로 가는 경로를 확보하는 것입니다. 양압을 가하고 마이크로 조작기를 사용하여 전극을 표본으로 이동시킵니다. 이 전극을 사용하여 내유모세포 기저 수준에서 표본에 절개를 가합니다.

양압을 이용하여 지지세포의 얇은 층과 내유모세포 사이로 전극을 밀어 넣어 내유모세포 기저부 영역으로 진입하는 경로를 확보합니다. 전극을 조심스럽게 제거하고, 세포 내 용액이 채워진 팁 직경 1 µm의 새로운 전극으로 교체합니다. 양압을 가해 전극 팁의 청결 상태를 유지하면서, 기록 전극을 진입 경로를 통해 인접한 지지세포 주변을 지나 구심성 바톤(afferent baton) 방향으로 이동시킵니다.

전극 팁이 구심성 신경 말단(afferent bouton) 바로 앞에 있는지 확인하십시오. 신경 말단은 지지 세포나 내유모세포 막보다 피펫 이동에 더 큰 저항을 줍니다. 피펫을 움직일 때 이러한 차이를 느낄 수 있으므로, 피펫을 위아래로 움직이며 밀어서 신경 말단이 움직이는지 확인하십시오. 이는 피펫 팁과 신경 말단이 동일한 초점 평면에 있으며 전극이 구심성 신경 말단에 밀착되었음을 나타냅니다. 동시에 양압을 해제하고 흡입력을 가해 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성하십시오.

전극 내의 막을 파열시켜 전체 세포 기록(whole cell recording)을 얻기 위해 가벼운 흡입을 짧게 가합니다. 패치된 세포가 구심성 바톤(afferent baton)인 경우, 전체 세포 기록 모드에서 작은 정전 용량 과도 현상(capacitive transients)이 관찰됩니다. 이 그림은 구심성 섬유에서 기록된 전형적인 과도 현상을 보여줍니다.

시냅스 활성 기록을 시작합니다. 구심성 섬유에서 자발적 활성이 나타나지 않는 경우, 더 높은 칼륨 농도의 세포 외 용액을 처리하여 유모세포를 탈분극시키십시오. 이 그림은 왼쪽의 AFF 섬유와 오른쪽의 내유모세포에 대한 전형적인 전류-전압 관계를 보여줍니다.

전류-전압 관계는 -84 mV의 유지 전위에서 -124 mV부터 +36 mV까지 10 mV 증분으로 전압 단계를 주어 기록하였습니다. 일부 트레이스의 오른쪽에 전압이 표시되어 있으며, 이는 구심성 섬유의 전류-전압 관계에 초점을 맞춘 것입니다. 대부분의 전압 단계 동안 흥분성 포스트시냅스 전류 또는 EPC가 나타남에 유의하십시오.

EPC는 약 +6 mV에서 극성이 반전되었습니다. 이 기록은 전압 개폐성 나트륨 전류를 차단하기 위해 tetrodotoxin을 처리한 상태에서 수행되었습니다. 차단제가 없었다면 빠르게 활성화되는 나트륨 내향 전류가 기록에 추가로 나타나 해당 기록이 구심성 섬유 기록임을 식별했을 것입니다. 과분극 전압에서 느리게 활성화되는 내향 전류에 주목하십시오.

이 전류는 내유모세포나 지지세포에서는 나타나지 않으며, 이는 기록된 신호가 구심성 섬유로부터 온 것임을 보여주는 좋은 지표가 됩니다. 이 기록들은 내유모세포의 전류-전압 관계를 보여줍니다. 화살표는 양의 전위에서 빠르게 활성화되는 외향성 칼륨 전류를 가리킵니다.

이어서 좁은 피펫 직경과 높은 접근 저항으로 인해 지연 정류 칼륨 전류가 나타납니다. 여기에 표시된 내유모세포 전류는 내유모세포 전류의 정확한 기록을 얻기 위해 예상되는 값보다 작습니다. 더 낮은 접근 저항을 가진 피펫을 사용해야 합니다.

하지만, 여기서 제시된 기록은 내유모세포와 구심성 섬유의 전류-전압 관계가 명확하게 구분될 수 있음을 보여줍니다. 이 그림은 구심성 섬유에서 기록된 시냅스 전류를 나타냅니다. EPC의 크기와 모양이 다양함에 유의하십시오.

기록은 전압 개폐성 나트륨 전류를 차단하기 위해 tetra etylammonium(tetra toin)을 처리한 상태에서 실온에서 수행되었습니다. 이 그림은 내유모세포와 이에 접촉하고 있는 구심성 바톤(afferent baton)으로부터 동시에 기록한 결과를 보여줍니다. 전압 스텝(voltage step)을 사용하여 내유모세포를 탈분극시켰으며, 이에 반응하여 내유모세포에서 내향 칼슘 전류가 기록되었습니다. 칼슘 유입은 신경전달물질의 방출을 유도하며, 이는 구심성 바톤 내의 EPC를 활성화합니다.

참고로, 이 실험 절차를 수행하는 동안 50 millisecond의 내유모세포 탈분극 시 시냅스 억제가 나타납니다. 와우 조직을 박리하고 준비할 때 주의를 기울이는 것이 중요하며, 구심성 말단에서 기록을 시도할 때 인내심과 긍정적인 태도를 유지하는 것이 중요합니다.