골격근에서 Mitochondrial 절연

이 절차의 전반적인 목표는 미토콘드리아를 분리하고 미토콘드리아 호흡을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 Sprague Dawley 쥐로부터 골격근을 분리함으로써 수행됩니다. 그 다음, 근육을 균질화하고 원심분리를 통해 미토콘드리아를 분리합니다.

그 후 Bradford assay를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 마지막으로, 폴리그라피(polygraphy)를 통해 미토콘드리아 호흡을 측정합니다. 결과적으로, 서로 다른 미토콘드리아 호흡 상태에 따른 산소 소비량을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 미토콘드리아 기능에 대한 다양한 중재의 효과와 같이 골격근 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 골격근 대사에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 간, 뇌, 신장 또는 거의 모든 조직과 같은 다른 장기에도 적용될 수 있습니다. 절차를 시작하기 전, 골격근을 분리하기 위해 P-B-S, 10 millimolar EDTA가 첨가된 P-B-S, 8배 농도의 미토콘드리아 분리 완충액(mitochondria buffer isolation buffer 1 또는 IB 1), 분리 완충액 2(IB 2) 및 실험 완충액(eb)을 준비하십시오.

지침은 함께 제공된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 원심분리기를 켜고 온도를 4°C로 설정하십시오. 항온수조를 켜고 온도를 37°C로 설정하십시오.

적당한 크기의 버킷에 10 mL 비커 3개, 포터 엘보우(potter elbow), 조직 분쇄기(tissue grinders), 소형 수술용 가위, 그리고 10 µL 마이크로 원심분리 튜브를 넣고 얼음 위에 둡니다. 모든 도구와 시약은 실험 전 과정 동안 차갑게 유지해야 합니다. IB 1과 IB 2는 얼음 위에 두고, EB는 온수욕(warm water bath)에 넣습니다.

그런 다음 얼음 위에 놓인 세 개의 비커에 다음 용액들을 각각 추가합니다. 비커 1에는 10 milliliters의 PBS를, 비커 2에는 10 milliliters의 P-B-S-E-D-T-A를, 비커 3에는 3 milliliters의 ib. 1을 넣습니다. 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 절차에 따라 쥐를 안락사시킵니다.

다음으로 핀셋과 mayo Clinic 가위를 사용하여 골격근 250 to 500 milligrams를 신속하게 분리합니다. 이를 beca one으로 헹군 후, beca two로 옮겨 근육을 균질화합니다. 먼저 beaker three로 옮긴 다음, 마지막으로 가위로 잘게 다집니다.

용액을 Potter Elva 조직 균질기에 옮기고, 튜브를 항상 얼음에 둔 상태에서 전동 페스틀을 사용하여 근육 조직을 10회 균질화합니다. 그다음, 균질액을 미리 냉각시킨 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 700 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새로운 냉각된 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 펠릿은 폐기합니다.

4°C에서 10,500 Gs로 10분간 원심분리하여 얻은 S 상층액을 미리 준비된 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, SN1 및 근육 유형으로 라벨을 부착합니다. 펠렛을 500 µL의 IB 2에 현탁시킨 후, 4°C에서 10,500 Gs로 10분간 원심분리합니다. 상층액을 미리 준비된 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 SN2 및 근육 유형으로 라벨을 부착합니다.

최종 미토콘드리아 펠릿을 100 µL의 IB two에 현탁합니다. 미니 원심분리기로 몇 초간 원심분리합니다. 펠릿이 형성된 경우, 상층액을 미리 준비된 새 미세 원심분리 튜브로 옮기고 펠릿은 폐기합니다. 산소 전극의 보정은 본 프로토콜의 핵심 단계이며 매일 수행해야 합니다.

전극의 보정은 미토콘드리아 분리 과정 중에 완료할 수 있습니다. 우선, 250 milliliter 플라스크에 증류수 100 milliliters를 넣고 20분 동안 격렬하게 교반합니다. 물을 대기 가스와 평형시키기 위해, GRAT 전극을 50% 염화칼륨 몇 방울로 덮어줍니다.

다음으로 전극 위에 파란색 rizla 롤링 페이퍼 조각을 작게 잘라 올립니다. 그런 다음 롤링 페이퍼 위에 PTFE 멤브레인 조각을 올립니다.

링 어플리케이터를 사용하여 내부 링을 장착한 다음, 전극 홈에 외부 링을 배치하십시오. 전극을 연결하고 더 큰 플라스틱 링 베이스, 미토콘드리아 챔버 및 워터 호스를 조립하십시오. GRAT 박스의 전원을 켜고 GRAS 소프트웨어를 실행하십시오.

평형을 맞춘 물을 미토콘드리아 챔버에 넣습니다. 그런 다음 스터 바를 넣고 스터 바를 작동시킵니다. 하드웨어를 클릭하십시오.

그런 다음 교반 속도를 조절합니다. 속도를 60으로 설정하고 클릭하십시오. 다음으로, 새로운 실험을 시작합니다.

'보정(calibrate)'을 클릭한 다음 '액상 보정(liquid phase calibration)'을 클릭하십시오. 첫 번째 상자에서 온도를 37 °C로 변경하고 '확인(okay)'을 두 번 클릭하십시오. '오버라이드(override)'가 '확인(okay)'으로 변경되면 이를 클릭하고 질소 가스 탱크를 여십시오.

질소 탱크에 연결된 팁을 챔버에 넣고 산소 농도를 0으로 설정합니다. override 상태에서 전환되면 확인(okay)을 클릭합니다. 물을 흡입해 제거하고 미토콘드리아 챔버에 EB 500 µL를 추가합니다.

플런저로 챔버를 밀봉합니다. 여러 개의 박스를 사용하는 경우, 각 박스에 대해 교정 단계부터 반복합니다. 새로운 실험을 시작하고 약 1분 동안 실행합니다.

신호를 안정시키기 위해, 각 챔버에 150 micrograms가 되도록 필요한 부피의 미토콘드리아 현탁액을 추가합니다. 해당 이벤트를 표시하고 계속 진행합니다. 1분 동안, 최종 농도가 5 millimolar glutamate 및 2.5 millimolar malate가 되도록 가온된 250 millimolar glutamate와 125 millimolar malate 10 microliters를 추가하고, 표시한 후 1분 동안 계속 진행합니다.

이를 상태 2로 정의합니다. 다음으로, 최종 농도가 150 micromolar가 되도록 10 millimolar a DP 7.5 microliters를 추가합니다. 그런 다음 표시하고 30초 동안 작동시킵니다.

이 상태를 상태 3으로 정의합니다. 10 mM ADP를 7.5 µL 추가하고 1.5분 동안 가동합니다. 최종 농도가 1 µM이 되도록 차가운 10 mM oligomycin 0.5 µL를 추가하고 3분 동안 가동합니다.

이를 상태 4로 정의합니다. 최종 농도가 0.2 µM이 되도록 차가운 0.1 mM FCCP 1 µL를 첨가하고, 3분 동안 RUM을 유지합니다. 이를 상태 5로 정의합니다.

완료되면 실험을 종료하고 저장하십시오. raft 소프트웨어를 사용하여 호흡률을 측정하십시오. 정규화 계수를 입력하십시오.

미토콘드리아 단백질 150 µg을 첨가하는 경우, 정규화 계수는 0.15가 됩니다. 서로 다른 호흡 상태에 대한 정규화된 호흡률을 계산하십시오. 상태 3을 상태 4로 나누어 호흡 조절 지수(RCR)를 계산하십시오.

이 그림은 골격근 미토콘드리아의 산소 소비량을 나타내는 대표적인 트레이싱을 보여줍니다. 전극 신호가 안정화된 후, 미토콘드리아 샘플을 GRAT 챔버에 첨가합니다. 두 번째 상태인 호흡은 glutamate와 malate를 첨가함으로써 시작됩니다.

ADP를 첨가하면 산소 소비량이 증가합니다. 이를 상태 3(state three) 호흡으로 정의합니다. 리그마이신(oligomycin)을 첨가하여 ATP 합성효소를 차단하면 상태 4(state four) 호흡이 유도됩니다.

마지막으로, 미토콘드리아 호흡을 탈커플링하기 위해 FCCP를 첨가합니다. 이 도표는 상태 2, 3, 4 및 5에 대한 대표적인 산소 소비율을 보여줍니다. 각 실험에 대해 호흡 조절 지수 또는 RCR을 계산합니다.

RCR이 4보다 크면 생존 가능한 미토콘드리아 조제물로 간주됩니다. 이 실험 절차를 수행하는 동안 미토콘드리아 시료를 항상 얼음에 보관하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 수행하십시오.

미토콘드리아 단백질 함량과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯(Western blot)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 골격근에서 미토콘드리아를 분리하는 방법과 미토콘드리아 호흡에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.