내생 와일드 타입 BRCA1을 표현 세포를 사용하는 동종 재조합에 BRCA1 변이의 효과를 확인

다음 실험의 전반적인 목적은 인비트로(in vitro) 상동 재조합 분석법을 사용하여 BRCA1 단백질의 특정 변이체를 테스트하는 것입니다. 이는 두 단계의 과정을 통해 이루어집니다. 먼저, BRCA1에 특이적인 짧은 간섭 RNA(siRNA)와 테스트하려는 BRCA1 변이 단백질을 재발현시키기 위한 플라스미드를 세포에 형질전환하여, 내성 야생형 BRCA1 단백질을 테스트 대상인 변이체로 대체합니다. 그 다음 단계로, 테스트 세포의 DNA 게놈 내 특정 부위에 DNA 손상을 유도하는 ICN1 단백질 발현 플라스미드와 함께, 돌연변이 BRCA1을 발현시키는 플라스미드 및 siRNA를 함께 도입합니다. 이어서 DNA 손상 및 수복이 일어날 수 있도록 세포를 2~3일 동안 배양합니다. 마지막으로, GFP를 발현하는 세포의 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 BRCA1 단백질의 특정 변이체가 상동 재조합에 의한 DNA 수복에서 기능을 수행하는지 확인하여 결과를 얻습니다.

이 기술은 상동 재조합에 의한 DNA 손상 복구 과정에서 특정 단백질 변이체를 분석하기 위한 다각적인 시스템을 구축하기 위해 기존의 두 가지 방법을 결합한 것입니다. 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이전 방법들이 BRCA1 유전자가 결손된 세포주에 의존했다는 점입니다. 본 연구에서는 HELOC 세포 유래의 더 다루기 쉬운 세포주를 사용하여, 내인성 단백질의 RNA 간섭을 통해 BRCA1을 고갈시킨 후 해당 세포에 테스트 단백질을 다시 도입하는 방식을 사용합니다.

이제 변이체 BRC1 단백질을 발현시켜 상동 재조합을 테스트할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 과정 중 발생하는 과도한 세포 사멸로 인해 어려움을 겪습니다. 따라서 세포 독성을 제한하면서 재조합 반응의 효과를 최대화할 수 있도록 transfection 조건을 세심하게 설정하는 것이 중요합니다.

본 프로토콜을 시작하기 전에, HeLa DR 13 nine 세포주는 HeLa 세포를 P-D-R-G-F-P로 형질전환하여 구축하였습니다. 안정적으로 형질전환된 세포를 선별하기 위해 10 centimeter Petri dish에서 pur mycin을 사용하여 세포주를 배양하십시오. P-D-R-G-F-P 플라스미드와 안정적 형질전환체 내의 재조합 기질에는 두 개의 비활성 GFP 대립유전자가 포함되어 있습니다. 그중 하나의 대립유전자는 ISCE one의 18 base pair 제한 효소 인식 부위가 포함되어 있어 비활성 상태입니다.

해당 코딩 서열에서 ISCE one의 발현은 이들 세포 내 불활성 GFP의 두 번째 대립유전자에 이중가닥 DNA 절단(DSB)을 생성합니다. 첫 번째 대립유전자의 ISCE one 부위와 상응하는 서열 부분은 야생형입니다. 이 두 번째 GFP 대립유전자는 DSB의 상동 재조합 수선을 위한 서열 공여체로 작용할 수 있으며, 그 결과 활성 GFP 대립유전자가 생성되어 첫 번째 형질전환 전날 유세포 분석법으로 쉽게 검출될 수 있습니다.

합쳐진 정도(confluency)가 90% 이상인 HeLa DR 13 9 세포가 배양된 10 cm 디쉬를 준비합니다. 1 mL의 trypsin을 처리하여 2~3분 동안 세포를 분리합니다. 9 mL의 DMEM-FBS를 첨가하여 반응을 중단시키고, 피펫팅을 통해 세포 현탁액을 잘 섞어줍니다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.5 mL의 DMEM-FBS가 담긴 상태에서 trypsin 처리된 세포 40 µL를 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

1일 차에 세포의 밀도는 40~50%로 유지되어야 합니다. 내인성 b RCA one을 고갈시키기 위한 irna와 B RCA one 돌연변이 발현 플라스미드를 optimum media에서 혼합하여 형질전환을 시작하십시오. 그 후, 핵산을 lip과 함께 optimum media에서 혼합하십시오.

트랜스펙션 후 제조사의 지침에 따라 리포펙토민(lipofectamine) 트랜스펙션을 진행하십시오. 세포를 다시 인큐베이터로 옮깁니다. 4~6시간 후에 항생제가 포함되지 않은 배지로 교체하십시오.

둘째 날에 세포를 다시 배양기에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. 각 웰에 0.3 milliliters의 trypsin 시약을 첨가하여 세포를 trypsin 처리합니다. 37 °C에서 잠시 배양한 후, trypsin 시약 내에서 세포를 피펫팅하여 세포를 떼어냅니다. trypsin 처리가 완료되면, trypsin 활성을 중단시키기 위해 2 milliliters의 D-M-E-M-F-B-S가 담긴 6-웰 플레이트로 세포를 24-웰 플레이트에서 옮깁니다.

최초 형질전환 2일 전과 동일한 조건에서 6-웰 플레이트를 하룻밤 동안 배양하십시오. Opti-MEM 62.5 µL에 SIR A, BRCA1 돌연변이 발현 플라스미드 DNA 및 ISCE1 발현 플라스미드를 준비하십시오. 이 용액을 2.5 µL의 LIPECTOMY 2060 및 2.5 µL의 Opti-MEM과 혼합하십시오.

4~6시간 동안 배양한 후 세포 형질전환을 진행합니다. 배지를 항생제가 포함되지 않은 D-M-E-M-F-P-S로 교체합니다. 6일 차에 세포를 다시 인큐베이터로 옮깁니다.

각 웰에 0.5 milliliters의 trypsin 시약을 첨가하여 세포를 trypsin 처리합니다. 2 milliliters의 D-M-E-M-F-B-S를 첨가하여 반응을 중지시킵니다. 상온에서 1000 RPM으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 신선한 D-M-E-M-F-B-S 1 milliliter에 세포를 재현탁하고, 웰당 10,000개의 세포를 대상으로 GFP 발현을 분석합니다.

유세포 분석법을 통해 전방 산란광과 측방 산란광 파라미터를 사용하여 살아있는 단일 세포를 게이팅합니다. GFP 양성 세포는 GFP 형광 검출기를 통해 선별하며, 결과는 히스토그램으로 나타냅니다. 나머지 세포들은 형광 사진 촬영을 위해 다시 플레이트에 접종할 수 있습니다.

원하는 BRCA1의 현미경 관찰 결과, BRCA1은 상동 재조합에 의한 이중 가닥 DNA 절단 복구 경로를 조절합니다. 상동 재조합을 통해 복구가 이루어진 세포는 형광 현미경으로 쉽게 검출할 수 있습니다. RNAi에 의한 BRCA1의 고갈은 검출되는 GFP 양성 세포의 급격한 감소를 초래합니다.

FCA의 결과물은 x축에 세포당 GFP 강도가, y축에 세포 수가 표시된 히스토그램입니다. 발현 플라스미드가 형질전환되지 않은 I SCE의 경우, GFP 양성 세포가 검출되지 않습니다.

2열부터 6열까지의 결과는 모두 3일차에 ISC one 발현 플라스미드가 형질전환된 세포에서 얻은 것입니다. 단일 실험의 전형적인 결과 세트에서, ISC one 발현 및 관련 없는 유전자에 대한 대조군 RNAi 결핍 후에는 세포의 15.5%가 GFP 양성을 보였습니다. 이에 비해 BRCA one의 결핍과 빈 플라스미드 벡터의 추가(add back)는 GFP 전환율을 0.7%로 감소시켰습니다. 외인성 야생형 BRCA one의 추가는 15~16%의 GFP 양성 세포를 얻음으로써 상동 재조합을 완전히 복구시켰습니다.

마찬가지로, 다른 미분류 변이(variant of unknown significance)의 발현 결과, BRCA1 21B 돌연변이는 BRCA1 의존적 상동 재조합 기능을 완전히 회복시켰습니다. 반면, BRCA1 M18T 돌연변이를 다시 도입했을 때는 벡터 대조군과 유사한 효과를 보였습니다.

이 변이체는 내인성 단백질과 유사한 수준으로 발현되었으므로, 이는 BRCA1 M18T 변이체가 상동 재조합에서 기능을 하지 않음을 시사합니다. 이 절차를 수행할 때는 세포의 성장을 모니터링하는 것이 중요하며, 세포가 낮은 밀도로 천천히 성장하므로 사용하는 형질전환 혼합물의 양을 줄여야 한다는 점을 유념해야 합니다. 또한, 적절한 시기에 형질전환 배지를 제거하는 것이 중요합니다.

형질전환 후 며칠 동안 배지에 항생제가 포함될 경우 세포 독성이 높게 나타나는 것을 확인하였습니다. 이러한 이유로, 1일 차 이후의 모든 배지에서는 항생제를 제외하였습니다. 이 기술은 유방암 연구 분야의 연구자들이 암 진료소에서 임상적 의미가 알려지지 않은 BRC 1 변이체의 유전학을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

본 연구에서 개발한 기능적 BRC one 분석법이 BRC one 변이가 암 소인에 미치는 영향에 대한 예측력을 향상시키는 데 기여하기를 바랍니다.