에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

이 실험 절차의 전체적인 목표는 드립 흐름 바이오필름 반응기(drip flow biofilm reactor) 또는 회전 디스크 반응기(rotating disc reactor)를 사용하여 낮거나 중간 정도의 전단력 하에서 박테리아 바이오필름을 배양하는 것입니다. 바이오필름 반응기 내의 쿠폰에 박테리아를 먼저 접종하고 37 °C에서 배양하여 박테리아 세포가 성장 표면에 부착되도록 합니다. 세포가 쿠폰에 부착되면 성장 배지의 흐름을 시작하여 바이오필름 발달 과정 동안 작용하는 전단력을 생성합니다.

성숙한 바이오필름을 수확하여 분석하고 관찰할 수 있습니다. 주사 전자 현미경을 사용하여 생성된 바이오필름의 초미세 구조를 결정할 수 있습니다. 저는 Blaze Balls입니다.

이 기술이 플로우 셀(flow cells)과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 높은 바이오매스 생산량을 달성하기 쉽고, 동일한 바이오필름을 여러 개 생성할 수 있다는 점입니다. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 기술원인 Rachel Stevenson과 대학원생인 Kelly Schwartz가 맡아 진행하겠습니다. 드립 플로우 바이오필름 리액터(drip flow biofilm reactor)는 배지 주입을 위한 입력 포트와 폐액 배출을 위한 유출 포트가 있는 4개의 챔버로 구성되어 있습니다.

각 챔버 내부에는 바이오필름이 성장하는 제거 가능한 쿠폰이 들어 있습니다. drip flow 바이오필름 리액터를 조립하려면, 각 평행 챔버에 쿠폰을 배치하고 챔버 덮개를 고정하십시오. 사용 전 시스템을 멸균하기 위해 조립된 리액터와 유입 영양분 튜브를 오토클레이브하십시오.

멸균된 드립 흐름 반응기에 접종하기 위해 바이오필름 성장 배지 또한 오토클레이브로 멸균합니다. 장치를 평평한 표면에 놓고 유출 라인을 클램프로 고정합니다. 다음으로, 각 챔버에 10 milliliters의 멸균된 triptych soy broth 기반 성장 배지를 채우고, 100 microliters의 staphylococcus aureus를 첨가합니다.

각 챔버에 동일한 배지로 배양한 하룻밤 배양액을 각각 접종합니다. 세포가 쿠폰 표면에 부착될 수 있도록 접종된 반응기를 37 °C 인큐베이터에서 18시간 동안 배양합니다. 배양 후, 유출 튜브의 클램프를 풀고 반응기를 10도 각도의 경사진 나무 블록 커터 위에 무균적으로 배치합니다.

유동 영양액 튜브를 연속 흐름 영양 배지가 들어 있는 병에 연결합니다. 튜브 라인을 펌프에 통과시킨 후, 펌프를 최대 속도로 가동하여 튜브 내부의 공기를 제거(prime)합니다. 유동 튜브의 프라이밍이 완료되면 펌프를 멈추고, 각 튜브 끝에 22게이지 1인치 바늘을 부착합니다.

에탄올 솜으로 챔버 입구 마개를 닦아 무균 상태로 만듭니다. 입구 마개를 통해 바늘을 삽입합니다. 펌프를 켜고 배지가 쿠폰 위로 떨어지게 합니다.

약 125 µL/min의 유량으로, 배지가 입구 스토퍼 포트에서 유출 포트로 아래 방향으로 흐르도록 합니다. 반응기를 3일 동안 연속 흐름 방식으로 가동하며, 배수가 적절히 이루어지는지 주기적으로 확인합니다.

배지가 챔버 내에 고여 있지 않은지 챔버를 육안으로 검사하여 배수가 원활한지 확인합니다. 배지가 고여 있는 경우, 유출 튜브를 꼬집어주면 일반적으로 바이오필름 수확을 위한 적절한 배수가 촉진됩니다. 펌프를 멈추고 반응기에서 바늘을 제거하십시오. 그 다음 반응기를 평평한 표면에 놓으십시오.

3일 동안 연속 흐름을 유지한 후, Staphylococcus aureus 바이오필름은 접종된 쿠폰의 길이를 따라 퍼진 노란색 바이오매스로 나타납니다. 바이오필름의 주사전자현미경 사진을 통해 Staphylococcus aureus가 표면 결합 바이오필름 커뮤니티 형태로 쿠폰을 덮고 있는 것을 확인할 수 있습니다. 얻어진 바이오매스를 정량화하기 위해, 멸균 집게를 사용하여 무균적으로 쿠폰을 제거하고, 세포 스크래퍼를 사용하여 박테리아를 수확한 다음, 5 mL의 멸균 PBS가 들어 있는 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

조직 균질기를 사용하여 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 세균 덩어리를 분해합니다. 연속 희석액을 triptych soja agar 플레이트에 도말하고 37 °C에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 수를 측정하여 콜로니 형성 단위를 정량화합니다. 회전 원판 바이오필름 반응기는 배양액이 펌핑되는 케모스탯으로 구성됩니다.

스타 바(star bar)가 달린 회전 디스크와 회전 디스크에 맞게 설계된 18개의 쿠폰입니다. 반응기를 조립하려면 먼저 회전 디스크의 슬롯에 쿠폰을 장착하십시오. 그다음 장착된 디스크를 오버플로우 포트가 있는 1L 유리 비커 안에 넣고, 배지 흐름용 구멍 하나와 폭기용 구멍 하나가 있는 15번 고무 마개로 반응기를 밀폐하십시오.

시스템을 멸균하기 위해 오토클레이브로 조립된 반응기와 입구 튜브를 멸균합니다. 반응기에 접종하려면, 비커에 250 milliliters의 멸균 배지를 채우고 triptych soy broth에서 하룻밤 동안 배양한 staphylococcus aureus 배양액 500 microliters를 첨가합니다. 반응기를 250 rotations per minute으로 설정된 교반기에 올리고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 쿠폰에 부착되도록 합니다.

밤새 배양한 후, 유입 튜빙을 배지 저장조의 포트와 연동 펌프에 연결합니다. 펌프를 켜고 유량을 0.25 milliliters per minute로 설정하십시오. 생성된 바이오필름을 수확하기 위해 반응기를 37 degrees Celsius에서 24시간 동안 가동합니다.

반응기를 정지시키고 무균적으로 조작하십시오. 쿠폰에 닿지 않게 디스크를 제거합니다. 멸균된 핀셋을 사용하여 쿠폰을 꺼내고, 각 쿠폰을 멸균 PBS에 조심스럽게 담가 항균 화합물 테스트를 위해 느슨하게 부착된 박테리아를 제거하십시오.

무균 상태에서 관심 화합물이 포함된 96-웰 플레이트의 개별 웰에 쿠폰을 넣습니다. 플레이트를 37°C에서 4시간 동안 배양합니다. 그 다음 쿠폰을 1× PBS가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 균질기를 사용하여 바이오필름을 분산시킵니다.

마지막으로, 앞서 설명한 대로 세포의 단계별 희석액을 영양 한천 배지에 도말하여 샘플당 생존 콜로니 형성 단위 수를 결정합니다. 이 그래프는 회전 디스크 반응기를 사용하여 제작하고 과산화수소에 노출시킨 바이오필름의 콜로니 형성 단위 수를 보여주며, 최대 18개의 동일한 바이오필름을 생성할 수 있는 능력을 나타냅니다. 회전 디스크 반응기를 사용하면 이 기술을 항균 화합물 테스트에 이상적으로 활용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 적하 흐름(drip flow) 및 회전 디스크 반응기(rotating disc reactor) 바이오필름을 운용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 바이오필름 반응기는 유동 셀(flow cell) 및 마이크로타이터 플레이트 바이오필름의 대안을 제공하며, 다량의 바이오필름 바이오매스가 필요하거나 형성된 바이오필름에 대한 항균 테스트를 수행하고자 할 때 이상적입니다.