컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제한된 샘플 내에서 편향되지 않은 대표 데이터를 수집하고 조직의 복잡한 3차원 구조를 정밀하게 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 면역조직화학적으로 염색된 췌장 절편의 가상 슬라이스를 캡처합니다. 그 다음, ImageJ 소프트웨어의 IHC 가상 슬라이스 매크로를 사용하여 가상 슬라이스를 정량화하고, Mathematica용으로 작성된 스크립트를 통해 데이터를 분석합니다.

다음으로, Image J를 사용하여 가상 슬라이스의 3D 재구성을 수행합니다. 절차의 마지막 단계는 slide book 소프트웨어를 사용하여 개별 islet 이미지 스택을 캡처하고, stereo investigator를 사용하여 이미지 스택을 3차원으로 수동 매핑하는 것입니다. 결과적으로 3D 이미징과 수동 매핑의 결합 방법을 통해 각 islet 세포의 3D 좌표가 포함된 정밀한 islet 구조를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 생리학적 및 병리학적 상태가 췌장 베타 세포 질량, islet 분포 및 구조에 어떤 영향을 미치는지와 같은 비만 및 당뇨병 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

베타 세포 질량 변화에 대한 더 깊은 이해는 치료적 개입의 개발과 평가를 촉진할 것이므로, 이 기술의 시사점은 비만 및 당뇨병(diabetes Melitis)의 진단 또는 치료로 확장됩니다. 본 연구에서 설명한 방법은 특히 췌장의 역동적인 면역조직화학적 분석에 대한 통찰력을 제공하지만, 다양한 다른 생물체와 조직에도 적용될 수 있습니다. 컴퓨터 보조 분석 단계는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

2차원 및 3차원에서 이러한 대규모 데이터 세트를 분석하는 과정이 복잡하기 때문입니다. 화학적으로 염색된 췌장 면역조직화학 절편 전체가 놓인 깨끗한 슬라이드를 형광 현미경 홀더에 배치하여 이 절차를 시작하십시오. Stereo Investigator 소프트웨어를 실행하고 acquisition을 클릭하여 샘플을 시각화하십시오.

그다음 라이브 이미지 모드로 전환합니다. 형광 강도를 나타내는 비디오 히스토그램 창을 사용하여 각 채널의 노출 수준을 결정합니다. 이 예시에서는 채널 2를 DAP P에, 채널 3을 GFP에, 채널 4를 RFP에, 채널 5를 sci 5에, 그리고 채널 6을 SCI 7에 사용합니다.

카메라 설정 창을 사용하여 형광 강도가 서서히 감소하도록 노출 수준을 조정하십시오. 비디오 히스토그램의 오른쪽 끝을 보며 현미경 초점 조절 휠로 이미지의 초점을 맞출 수 있습니다. 가상 절편(virtual slice)을 생성하기 전, 샘플에서 떨어진 화면상의 한 지점을 클릭하여 기준점을 표시함으로써 샘플의 윤곽을 잡으십시오.

그 후 윤곽선 작업이 완료되면 샘플의 외곽선을 따라 클릭하십시오. 윤곽선이 닫히면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'close contour'를 선택하여 시작점과 끝점을 연결한 다음, 'acquisition'을 선택하고 'acquire virtual slice'를 클릭하여 샘플의 가상 슬라이스를 캡처하십시오. 가상 슬라이스 창 옵션이 열리면 'high speed acquire'를 선택하고 'manual' 옵션을 비활성화하십시오.

manual 옆의 확인란을 해제하여 포커싱을 설정합니다. 파일을 저장합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 focus site list에 추가를 선택하여 prefo를 교정합니다.

가상 슬라이스 미리보기에서 무작위로 여러 구역의 초점을 수동으로 맞춥니다. 여러 지점의 초점이 맞춰지면, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'Start virtual slice with prefo'를 선택하여 가상 슬라이스를 시작합니다. 첫 번째 샘플의 가상 슬라이스가 완료되면, 다음 채널로 전환하고 노출을 적절히 조정합니다. 이 과정을 각 채널마다 반복하여 아이렛(eyelets)의 정량 분석을 수행합니다. I-H-C-V-S라는 이름의 ImageJ 매크로를 사용하여 이미지를 처리하며, 이 매크로는 먼저 로드된 이미지를 분석 가능하게 준비한 다음 세포 구성과 같은 아이렛의 특징을 정량화합니다.

I-H-C-V-S 매크로는 스택을 각각의 색상 채널로 분리합니다. ImageJ에서 각 이미지를 8비트 흑백 마스크로 변환합니다. 자동 강도 임계값 설정 후, 분리된 채널 이미지들을 산술적으로 합산하여 복합 마스크를 생성합니다.

합성 이미지에 대해 Image J의 내장 입자 분석(particle analysis) 기능을 사용하여 베타 세포 하나보다 작은 입자들은 제외하고 관심 영역(ROI)을 식별합니다. Image J를 이용한 ROI 정량화를 통해 세포 파라미터가 포함된 스프레드시트를 생성합니다.

집계된 결과를 Excel 스프레드시트에 저장하십시오. 각 아이렛(eyelet)에 대한 면적, 둘레, 원형도, 페룰(fer) 직경, 아이렛 중심과 같은 데이터와 이미지에 표시된 해당 번호를 함께 저장합니다. 이러한 파라미터의 계산 분석은 서면 프로토콜에 기술된 대로 수행할 수 있습니다. 아이렛 분포 및 빈도 분석을 포함한 정보를 확인하려면, 디렉토리 내의 모든 JPG 이미지를 TIF 파일로 변환하는 스크립트를 실행하여 가상 단면의 3D 재구성을 수행하십시오. TIF는 가상 단면으로부터 3차원 스택을 구축하고 정량화하는 데 사용되는 형식입니다.

여기서는 I MJ two two tiff라는 스크립트가 사용됩니다. 해당 스크립트를 JP two 이미지들이 포함된 디렉토리에 복사하십시오. 콘솔에 dot slash I am JP two two TIFF를 입력하고 엔터 키를 눌러 리눅스 쉘에서 스크립트를 실행하십시오.

캡처한 모든 이미지가 JPEG2에서 TIFF 파일로 변환되면, Image J에서 분석에 사용할 준비가 된 것입니다. Image J를 사용하여 첫 번째 샘플(이 경우 인간 태아 췌장)의 모든 이미지를 열고, Image, Color, Merge Channels를 순서대로 선택하여 하나의 이미지로 병합합니다. 모든 샘플이 단일 이미지로 병합될 때까지 각 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 다각형 선택 도구(polygon selections tool)를 사용하여 원하지 않는 영역을 선택함으로써 이미지를 정리합니다.

'편집(edit)'을 선택한 다음 '채우기(fill)'를 클릭하여 채웁니다. 각 이미지를 RGB 컬러 이미지로 변환하십시오. 마지막으로 이미지들로 스택(stack)을 생성하며, 이후 stack reg 플러그인을 사용하여 추가로 정렬할 수 있습니다.

최종적으로, 채널을 병합하고 이미지를 결합하면 췌장 전체의 모든 아일렛(eyelets)에 대한 3D 몽타주가 생성됩니다. 이미지 스택을 수집하려면, 전체 마운트된 췌장 아일렛을 현미경 아래에 배치하십시오. 수침식 대물렌즈를 사용하는 경우 물을 도포하십시오.

슬라이드 북 소프트웨어를 실행하고, 포커스 제어 창에서 Ctrl+Shift+E를 눌러 캡처 및 포커스 제어 메뉴에 접속하십시오. 아이렛의 크기에 따라 대물렌즈를 20배 또는 40배로 설정하십시오. 현미경 접안렌즈를 사용하여 아이렛의 위치를 찾으려면 bin을 2배로 설정하고 필터 세트를 user 1로 설정하십시오.

초점 제어 창에서 방출 선택을 100%로 설정하고, 중성 농도를 한 클릭 GFP ey로 설정한 다음, 슬라이드 북에서 샘플을 시각화하기 위해 바닥면(floor)을 엽니다. 다시 초점 제어 창으로 돌아가 필터 세트를 fix로 전환합니다. 그런 다음 G-F-P-D-S를 클릭합니다. 조이스틱을 사용하여 카메라 1 창에서 아이렛(eyelet)을 최대한 중앙에 맞춥니다.

세포를 쉽게 식별할 수 있는 아이렛(eyelet) 중심 부근의 깊이에 초점을 맞춥니다. 초점 제어 창에서 zab을 선택하십시오. 스코프 제어기를 사용하여 특징이 명확하게 식별되는 아이렛의 최상단 깊이까지 스크롤한 후, set top을 클릭하십시오.

아이렛(eyelet)의 맨 아래로 스크롤한 후 '설정(set)'을 클릭하십시오. 하단 클릭 후 '시작(go)'을 누르십시오. 캡처 창의 기준점으로 돌아가려면 '고급(advanced)'을 클릭한 다음 '채널 모드(channel mode)'의 '대체(alternate)'를 클릭하십시오.

창의 오른쪽에서 bin factor를 2배로, capture type을 3D로 설정하십시오. use top and bottom positions와 return to center volume after capture를 클릭하십시오. step size를 3으로 설정하십시오. filter set 박스 아래에서 filter set을 live로 설정하십시오.

DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U 및 SCI five DSU를 선택하십시오. 각각의 항목에 대해 노출 조정(adjust exposure) 아래의 최적값 찾기(find best)를 클릭하십시오. 그런 다음 테스트(test)를 클릭하여 선택한 노출 값이 적절한지 확인하십시오.

시작을 클릭하여 캡처를 시작하십시오. 캡처가 완료되면 필요에 따라 레벨을 조정하고 RFP의 표시 색상을 흰색으로 변경하십시오. 슬라이드를 저장하고 TIFF 시리즈 내보내기 뷰로 이동하십시오.

슬라이드 이름 끝에 대시(-)를 입력하고 저장하십시오. 수십 개의 개별 TIF 파일이 생성되므로, 각 아이렛(eyelet) 이미지 스택을 별도의 폴더에 보관하는 것이 유용할 수 있습니다. 이미지 스택을 매핑하려면 Stereo Investigator 소프트웨어를 실행하십시오.

이미지 스케일링 메뉴에서 이미지 스택을 열어 이미지를 시각화하십시오. 2배 굴절을 보정하기 위해 이미지 간 거리를 3 µm로 설정하십시오. 슬라이드 북(slide book)에서 X 및 Y 스케일링 재정의(override X and Y scaling)를 선택하고, X 및 Y 스케일링 소스로 지정된 값(specified)을 사용하십시오.

X 및 Y 중심값에 각각 0.65를 입력하고 확대 버튼을 클릭하여 이미지를 확대하십시오. 그다음 매크로 창에서 관심 있는 섬(islet)의 중앙에 있는 세포를 최소 하나 이상 표시하십시오. 적절한 마커를 사용하면 베타 세포는 녹색으로, 알파 세포는 빨간색으로, 델타 세포는 흰색으로 표시됩니다.

DPI로 염색된 샘플의 경우 핵이 파란색으로 나타나는데, 핵의 중심부를 표시하십시오. 마커 2로 베타 세포를, 마커 5로 알파 세포를, 마커 6으로 델타 세포를 표시하십시오. 최소 하나 이상의 세포가 표시되면 상단 메뉴의 아이콘을 사용하여 직교 뷰(orthogonal view)를 표시하고, Z 필터와 대칭(symmetric) 항목을 확인하십시오.

범위는 15.00으로 설정해야 합니다. 0.0 Z에서 시작하십시오. 마우스 휠을 사용하여 아이렛(eyelets)을 스크롤하고, 각 세포의 깊이 중심부에 적절한 마커로 한 번씩만 표시하십시오. 각 Z 레벨의 표시를 모두 마치면 Z 필터 체크 박스의 선택을 해제할 수 있습니다.

이렇게 하면 모든 Z 레벨의 모든 마커가 표시됩니다. 모든 세포에 마킹을 완료한 후, 파일을 DAT 파일로 저장하십시오. 그런 다음 파일의 tracing 내보내기(export tracing)로 이동하십시오.

트레이싱 결과물을 TXT 파일로 저장하십시오. 마지막으로, 새로운 아이렛(eyelet) 매핑을 시도하기 전에 'new data file'을 클릭하여 작업 공간을 비웁니다. 면역조직화학 염색된 췌장 시료로부터 가상 슬라이스를 제작하면, 췌장 전체의 알파, 베타 및 델타 내분비 세포를 췌도(islets)로서 함께 관찰할 수 있습니다. 인슐린에 대한 면역조직화학 염색은 녹색, 글루카곤은 적색, 소마토스타틴은 백색, 그리고 dap는 청색으로 나타납니다.

그 후 자동 임계값 설정을 통해 이미지를 8비트 마스크로 변환하였습니다. 여기에는 병합된 합성 이미지가 표시되어 있습니다. 하지만 가상 슬라이스를 이용한 eyelet 분포 분석을 통해 개별 채널에서의 개별 분석 또한 가능합니다.

여기에서는 delta 세포, beta 세포 및 alpha 세포를 드러내기 위해 각 채널의 뷰를 보여줍니다. 각 eyelet 구조에 번호를 매기고 파란색으로 강조 표시한 복합 마스크를 사용하여 입자 분석을 수행했습니다. 복합 마스크의 입자 분석 결과는 검출된 각 eyelet의 Islas 면적, 둘레, 원형도 및 다양한 직경과 같은 파라미터를 포함하는 데이터 테이블로 출력되며, 각 ID는 복합 마스크의 번호 표시 태그와 일치합니다.

이러한 이미지들에 대한 대규모 분석을 통해 전체 아일렛(eyelet) 수와 크기 분포 히스토그램을 생성하며, 알파, 베타 및 델타 세포 영역에 대한 상세한 비교 분석을 수행합니다. Stereo Investigator에 업로드된 인간 아일렛의 3D 재구성 이미지 스택으로부터 세포 구성 및 구조의 매핑과 수학적 분석을 통해 단일 초점 평면을 확인할 수 있습니다. 여기서 베타 세포는 녹색, 알파 세포는 적색, 델타 세포는 백색, 그리고 핵은 청색으로 표시됩니다.

개별 아이렛(eyelet)을 캡처한 후, 여기의 다양한 해수면 평면에서 알파, 베타 및 델타 세포를 표시하였으며, 10 microns 간격의 세 가지 서로 다른 초점 평면에 대한 형광 이미지와 해당 맵 데이터가 표시되어 있습니다. 다양한 평면에서 알파, 베타 및 델타 세포가 표시되면, 아이렛을 3D로 시각화할 수 있습니다. 여기에는 아이렛 매핑을 통해 얻은 좌표를 기반으로 한 4분할 절단 아이렛의 3D 재구성 모습이 나타나 있습니다.

또한, 매핑된 아이렛(eyelet)의 자동화된 수학적 분석을 통해 세포 구성과 구조를 나타낼 수 있습니다. 여기에서는 단일 세포 집단 내의 두 세포 간 거리의 상대 빈도를 보여줍니다. 또한, 서로 다른 두 세포 집단 간의 세포 거리의 상대 빈도도 함께 제시되어 있습니다.

또한 alpha-alpha, beta-beta 및 delta-delta 세포 간 거리 분포의 누적 확률이 표시되어 있습니다. 이러한 확률에 대해 Kolmogorov-Smirnov(KS) 검사를 수행하여 해당 KS 거리값을 얻을 수 있습니다. 숙련되면 조직 절편 전체에 대한 대규모 이미징 및 분석을 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.

조직 블록의 3D 재구성은 30분 이내에 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 적절하게 수행한다면 3D 이미징과 수동 매핑을 4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 섹션의 고품질 면역조직화학 염색부터 시작하는 것이 중요합니다.

이후 분석의 정확도는 모두 원천 데이터에 달려 있습니다. 또한, 개발 후 이러한 대규모 분석을 처리하기 위해 컴퓨터에 최소 8GB의 RAM이 확보되었는지 확인하십시오. 이 기술은 비만 및 당뇨병 분야뿐만 아니라 표준 병리학적 분석을 사용하는 많은 다른 분야의 연구자들에게 길을 열어주었습니다.

이 방법은 특히 샘플의 가용성이 제한적일 때 유용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 표준 기술을 사용하여 제한된 샘플 크기 내에서 편향되지 않은 대표 데이터를 수집하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 췌장 소도 분포 연구에서 보여준 바와 같이, 특정 영역만 선택하는 것은 전체 상황을 대표하지 못할 수 있습니다.