진드기의 RNA 간섭

이 실험 절차의 전반적인 목적은 주입을 통한 진드기의 RNA 간섭 기술을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자의 이중 가닥 RNA를 합성함으로써 수행됩니다. 그 다음 RNA를 진드기에 주입하고, 이후 24시간 동안 습도 챔버에 보관합니다.

이 유지 기간이 지난 후, 진드기를 양과 같은 동물에 붙여 흡혈하게 합니다. 체중, 탈피 및 난 위치와 같은 흡혈 파라미터와 real-time R-T-P-C-R을 통한 표적 유전자 또는 관심 유전자의 발현을 측정합니다. 최종적으로, 진드기의 생물학적 파라미터 평가와 real-time R-T-P-C-R을 이용한 유전자 발현 분석을 통해 표적 유전자 억제가 진드기 생물학에 미치는 영향을 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.

저희 연구팀은 진드기와 병원체 사이의 접점에서 발생하는 분자적 사건들을 규명하여, 이러한 기초 정보를 바탕으로 진드기 감염 및 인간과 동물로의 병원체 전파를 제어하는 방법을 개발하는 연구를 수행하고 있습니다. RNA 간섭은 진드기의 유전적 조작이 가능한 유일한 방법이기 때문에 이 연구에서 필수적인 도구로 부상했습니다. 많은 진드기 유전자의 기능은 아직 알려지지 않은 상태입니다.

RNA 간섭은 교미, 번식, 섭식, 소화, 타액선 기능 및 병원체 전송을 위한 진드기의 매개 능력 등 진드기 생물학의 여러 측면에서 진드기 유전자와 유전자 발현의 역할을 정의할 수 있게 해줍니다. 본 절차의 시연은 본 연구실의 진드기 RNA 간섭 팀인 Ed Lewin 박사, 대학원생 Busby 및 제가 진행하겠습니다. 이중 가닥 RNA를 생성하려면, 먼저 RNA의 인 비트로(in vitro) 전사를 위한 T7 프로모터 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하십시오.

예를 들어, derma center vari lesin의 경우입니다. 여기에 표시된 oligonucleotide 프라이머 D eight A a T 75 및 D eight DVT 73를 사용하십시오. 각 oligonucleotide 프라이머 10 picomoles와 tick total RNA 1~10 nanograms를 사용하여 R-T-P-C-R로 표적 유전자를 증폭합니다.

다음으로, PCR 산물을 정제하십시오. 그런 다음 8 µL 또는 약 100 ng을 사용하여 이중 가닥 RNA를 합성합니다. 주입을 위한 진드기를 준비하려면, 먼저 수돗물, 3% 과산화수소, 증류수 2회, 70% 에탄올, 그리고 마지막으로 증류수로 2회 세척하는 일련의 과정을 거치십시오.

각 세척 단계는 50 milliliter 일회용 원심분리 튜브에 넣고 흔들어 수행합니다. 그 후 고운 망의 와이어 스크린을 통해 용액을 따라내어 제거합니다. 진드기를 종이 타월 위에서 건조시킨 다음, 실험에 따라 20~50마리씩 그룹으로 분주합니다.

각 그룹을 밀폐 가능한 뚜껑이 있는 1.25 ounce 플라스틱 컵에 넣고, 각 컵에 실험 그룹 이름을 표시합니다. 다음으로, 주입 과정을 수행할 3명으로 구성된 RNAi 팀을 구성합니다. 첫 번째 사람은 빨간색 치과용 왁스 3 x 6 inch 시트에 부착된 양면 테이프 위에 각 진드기를 배치합니다.

두 번째 연구원은 진드기에 주사하고, 세 번째 연구원은 주사 후 진드기를 모니터링합니다. 진드기를 활성화하기 위해 이산화탄소를 분사한 뒤, 살아있는 진드기의 수를 세어 실험군 번호가 표시된 컵으로 옮깁니다. 모든 팀원은 일회용 장갑을 착용해야 합니다. 진드기 주사 과정을 시작하려면, Dumont 미세 핀셋을 사용하여 진드기를 잡은 뒤 빨간색 치과용 왁스 시트에 부착된 양면 테이프 위에 진드기의 배면이 위로 오도록 놓습니다. 진드기를 5마리씩 그룹으로 밀착시켜 배치합니다. 다섯 마리 진드기 모두의 구강 부위 위에 작은 마스킹 테이프 조각을 붙입니다.

더욱 확실하게 고정하기 위해, 진드기 주입자가 주입 과정을 관찰할 수 있도록 몸체의 대부분을 노출시킨 상태로 둡니다. 진드기에 주입하기 위해 29 gauge 0.5인치 바늘이 장착된 일회용 인슐린 주사기를 사용하여 외골격 복면의 우하단 영역에 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 45도 베벨 팁이 있는 33 gauge 1인치 바늘과 맞춤 제작된 Hamilton 주사기를 사용하여 0.2 to 0.5 µL의 이중 가닥 RNA 용액을 진드기에 즉시 주입하며, 이때 이중 가닥 RNA의 정확한 배치와 유지를 위해 바늘을 진드기 체강 깊숙이 삽입합니다.

주입 후 액체가 일부 유출되더라도, 주입 바늘을 깊게 삽입하면 진드기 체강 내에 충분한 이중 가닥 RNA가 전달되어 유전자 억제가 일어납니다. 다만, 혈림프 손실로 인해 진드기가 폐사할 수 있으므로 과도하게 주입하지 않도록 주의해야 합니다. 진드기에 주입을 마친 직후, 미세 핀셋을 사용하여 양면 테이프에서 진드기를 떼어내 플라스틱 회복 용기에 옮깁니다.

주입 후 진드기는 잠시 비활성 상태로 남아있겠으나, 곧 접시 안을 기어 다니기 시작할 것입니다. 진드기에게 이산화탄소를 불어넣어 활성화시키십시오. 진드기가 활발하게 기어 다니기 시작하면 주입 부위의 상처가 빠르게 치유되며, 대부분 생존할 가능성이 높습니다.

각 실험군 내의 진드기 수를 센 다음, 밀폐 가능한 뚜껑이 있는 라벨 부착된 플라스틱 컵에 각 군을 넣습니다. 다음 실험군에 주입하기 전에 현재 군에서 죽은 진드기가 있다면 교체합니다. 신선한 3% hydrogen peroxide로 해밀턴 시린지를 채운 후 배출하여, 다음 실험군에 주입하기 전 시린지를 세척합니다.

멸균수로 15회 세척한 후 다시 15회 세척합니다. Hamilton 시린지의 플런저가 구부러지지 않도록 주의하십시오. 플런저가 구부러지면 부드럽게 움직이지 않아 진드기 주사에 필요한 미세한 조작이 어려워집니다. 주입 후에는 진드기를 물과 황산칼륨으로 채운 용기가 들어 있는 챔버에 넣어 하루 동안 고습도 상태를 유지하며 보관합니다.

다음으로 개별 진드기를 양에 부착된 진드기 흡혈 셀에 넣고, 주입되지 않은 수컷 또는 암컷 진드기(주입되지 않은 성별)를 동일한 수로 함께 넣어 흡혈하도록 합니다. 약 10일 동안 흡혈을 마치거나 대조군 암컷 진드기가 숙주로부터 떨어져 나갈 때 흡혈 셀에서 암컷 진드기를 수집하고 무게를 잽니다. 각 진드기 그룹을 산란이 완료될 때까지 습도 챔버에서 배양합니다. 그룹별로 모든 진드기가 생성한 알 덩어리의 무게를 측정하여 산란 상태를 평가함으로써 흡혈 후의 진드기 표현형을 평가합니다.

생존한 진드기의 수를 결정하고, 진드기의 무게와 난황의 위치 및 알의 부화율을 계산합니다. 표적 유전자와 연구 목적에 따라, R-T-P-C-R을 통해 유전자 억제를 확인하기 위한 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 흡혈 후, 대조군 주입 그룹과 이중 가닥 RNA 주입 그룹의 개별 진드기에서 침샘과 장을 해부한 다음, 개별 조직 샘플에서 총 RNA를 추출합니다.

실시간 R-T-P-C-R을 통해 개별 조직의 표적 유전자 전사체를 분석하고, tick 16 s 리보솜 RNA를 기준으로 RNA 수준을 정규화합니다. gene norm 방법을 사용하여 반응 종료 시 해리 곡선을 실행함으로써 단일 앰플리콘만 형성되었는지, 그리고 모든 샘플에서 앰플리콘이 동일한 온도 범위에서 일관되게 변성되는지 확인합니다. 이후 학생 T-검정을 이용하여 대조군 주입 tick와 이중 가닥 RNA 주입 tick 간의 mRNA 수준에 대한 정규화된 CT 값을 비교합니다.

여기에 기술된 프로토콜은 당사 실험실에서 다양한 외래 진드기 종의 RNAi 연구에 사용되어 왔습니다. 진드기에 주입되는 이중 가닥 RNA의 양은 진드기의 크기에 따라 달라집니다. 크기가 더 큰 진드기 종일수록 더 많은 부피를 수용할 수 있습니다.

참고 문헌은 프로토콜의 동반 서면 부분에서 확인하실 수 있습니다. 프로토콜을 정확하게 수행했다면, 주입 절차 후 24시간 이내의 사망률은 5% 미만이어야 합니다. 진드이 보호 항원을 스크리닝하는 데 사용된 이중 가닥 RNA 풀을 진드이 패널에 주입한 후, 유전자 넉다운(knockdown)이 일어난 전형적인 표현형이 여기에 제시되어 있습니다.

광학 현미경으로 관찰한 진드기에서 진드기 조직의 세포 퇴행이 관찰될 수 있습니다. 표현형의 변화는 기능 상실을 동반할 수도 있습니다. 예를 들어, SUBIN의 RNAi는 암컷과 성공적으로 교미할 수 없는 불임 수컷을 생성합니다. 이는 RNA 간섭 처리 후 진드기 관찰 결과에 따른 것입니다.

실시간 R-T-P-C-R, 투과 전자 현미경 또는 공초점 현미경, 게놈학 또는 단백질체학을 포함하여 유전자 억제가 유전자 및 단백질 발현과 진드기 생물학에 미치는 영향을 결정하는 다른 방법들을 사용할 수 있습니다. RNA 간섭은 진드기 세포 배양에서도 수행될 수 있으며, 이는 진드기 세포와 병원체 간의 상호작용 연구를 위한 인비트로(in vitro) 방법을 제공합니다.