에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균

이 실험 절차의 전반적인 목표는 주어진 표적 DNA 서열에 대한 무작위 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 반정량적 기능 선택법을 사용하여 돌연변이체를 신속하게 식별 및 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 표적 서열을 포함하는 하나의 복제 원점을 가진 플라스미드를 mutator 균주에 형질전환함으로써 이루어집니다. 세포를 도말하고 하룻밤 동안 배양한 후, 세포를 수확하고 표적 플라스미드를 분리하여 돌연변이 라이브러리를 얻습니다. 이후 프로토콜의 두 번째 단계에서 돌연변이 라이브러리를 readout 균주에 형질전환하여 돌연변이의 특성을 분석합니다. 기울기 성장 플레이트(gradient growth plate)를 제작하고, 소프트 아가(soft agar)가 담긴 별도의 페트리 접시에 readout 균주의 박테리아 배양액을 접종합니다.

절차의 마지막 단계는 이러한 박테리아 배양물을 그라디언트에 스탬프 전사하는 것입니다. 결과적으로, 약물 그라디언트 상의 성장 차이를 통해 특정 표적 서열의 표현형 프로파일 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 비디오에서는 e coli 내 단백질의 지향적 진화를 위한 방법을 제시합니다.

이 과정은 무작위 영양소 라이브러리를 생성한 후 그 다양성을 제한하는 선택 과정을 거치는 자연 진화 과정을 모방한 것입니다. 따라서 이를 통해 산업적 또는 생의학적 목적을 위한 새로운 생화학적 활성을 생성하는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 이 절차는 무작위 돌연변이 라이브러리 생성과 기능 획득 돌연변이를 얻기 위한 기능적 선택이라는 두 가지 구성 요소로 이루어져 있으며, 본 절차의 시연은 저희 실험실의 기술원인 Jennifer Allen이 담당하겠습니다.

본 프로토콜을 시작하기 전, 서면 프로토콜에 기술된 대로 미리 준비된, 저충실도(low fidelity) DNA polymerase I(또는 저충실도 pol I) 변이체를 발현하는 전기 천공 가능(electro competent) JS 200 세포를 준비하십시오. 이 세포들은 pol I의 온도 민감성 대립유전자를 포함하고 있어, 37 °C에서 저충실도 pol I 활성이 우세하게 나타납니다. 타겟 서열이 복제 원점 인근에 클로닝된 coli 1 복제 원점을 포함하는 타겟 플라스미드를 구축하십시오. 저충실도 pol I이 coli 1 플라스미드 복제를 개시하며, 이를 통해 돌연변이를 도입하여 돌연변이 유발을 시작합니다.

2mm 갭(gap)의 전천공 큐벳에 전기천공 유능 세포 40 µL와 30~250 ng의 표적 플라스미드 DNA를 혼합합니다. 1800 V의 전압으로 혼합물에 전기천공 펄스를 가합니다. 각 샘플에 대해 균일한 전천공 조건이 유지되는지 확인하기 위해 시정수(TC)를 점검합니다.

이상적으로 TC는 5~6 ms입니다. 세포 DNA 혼합물을 1 mL의 LB 배지에서 37 °C로 250 RPM으로 진탕하며 40분 동안 회복시킵니다. 두 플라스미드를 모두 선택할 수 있는 적절한 항생제가 포함되어 있고 37 °C로 예열된 100 mm LV agro 페트리 접시를 준비합니다. 회복된 세포를 적절히 희석하여 이 예시에서 보여주는 것과 같이, 개별적으로 구분되지만 그 수를 셀 수 없는 정도의 밀도인 near lawn 농도로 도말합니다.

하룻밤 동안 배양한 후, LB 배지를 사용하여 페트리 접시의 박테리아 콜로니를 수확합니다. 수확한 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리합니다. 이렇게 얻은 플라스미드 DNA가 무작위 돌연변이 라이브러리가 됩니다.

표적 플라스미드와 폴 플라스미드(pole plasmid)를 모두 선형화하는 제한 효소로 플라스미드 라이브러리를 절단하여 제한 효소 소화를 수행합니다. 분리된 플라스미드 DNA의 품질과 양을 확인하기 위해 분석용 아가로스 겔 전기영동을 실시합니다. 플라스미드가 확인되면, 폴 플라스미드는 선형화하지만 표적 플라스미드는 절단하지 않는 제한 효소로 라이브러리 1 µg을 소화시킵니다.

제한효소 절단이 완료되면, DNA 정제 키트를 사용하여 라이브러리를 정제합니다. 마지막으로, 정제된 라이브러리를 판독 균주(readout strain)에 형질전환하여 돌연변이의 특성을 분석합니다. 구배(gradient) 준비를 시작하려면, 정사각형 페트리 접시 바닥의 한쪽 가장자리에 10개의 레인을 일정한 간격으로 표시합니다.

디시의 아래쪽 표시된 가장자리가 7 mm 높아지도록 경사지게 배치합니다. 적절한 농도의 선택제를 잘 혼합한 따뜻한 lb agar 25 mL를 경사 디시에 붓습니다. 이것이 구배의 하단 층이 됩니다.

LB agar가 페트리 접시를 코팅하여, 접시의 높게 표시된 끝부분에는 약 1 mm의 LB agar가 담기고 낮은 부분에는 약 8 mm가 담기도록 합니다. 환기를 위해 뚜껑 KU로 플레이트를 덮고 agar가 굳을 때까지 10 내지 15분 동안 둡니다. LB agar 하층이 굳으면 접시를 평평한 표면으로 옮깁니다.

다음으로, 선택제를 포함하지 않은 따뜻한 lb agar 25 milliliters를 부어 첫 번째 agri 표면을 덮고, 하단 층 전체가 완전히 덮이도록 합니다. 통풍을 위해 플레이트를 뚜껑 KU로 덮은 후, 박테리아의 스탬프 전이가 이루어질 수 있도록 agri를 10~15분 동안 굳힙니다. 먼저, readout strain의 박테리아 배양액을 확보하고, 600 nanometers에서의 광학 밀도가 1.0 미만이 되도록 희석하여 동일한 세포 밀도를 갖게 합니다.

다음으로, 42 °C로 평형을 맞춘 액체 소프트 아가 2 mL를 100 mm 원형 페트리 접시 바닥에 옮기고, 박테리아 배양액 40 µL를 소프트 아가에 피펫팅한 후 플레이트를 흔들어 섞습니다. 유리 현미경 슬라이드의 긴 모서리에 소프트 아가 혼합물을 도포합니다. 그다음, 슬라이드의 도포된 모서리를 그라디언트 접시 바닥의 표시선에 맞춥니다.

슬라이드를 한천 표면에 살짝 접촉시킵니다. 부드러운 한천 띠가 그래디언트 표면으로 옮겨가도록 가볍게 접촉하는 것만으로 충분합니다. 이후 슬라이드는 세척하여 재사용하기 위해 따로 둡니다.

이 과정을 반복합니다. 남은 샘플과 실험 대조군을 각 그라디언트 디쉬에 포함시켜야 합니다. 여러 개의 그라디언트를 수행하는 경우, 그라디언트 디쉬를 뒤집어 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 시간과 온도는 판독에 사용되는 박테리아 균주에 따라 다를 수 있으나, 일반적으로 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하면 가시적인 성장이 나타나기에 충분합니다.

마지막으로, 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포 성장을 이미징하고 분석합니다. 여기 P-G-F-U-V 비변이체 또는 4라운드의 돌연변이 유발 과정을 거친 PG FPUV 돌연변이 라이브러리를 형질전환한 리드아웃 균주의 이미지가 제시되어 있습니다. 어둡거나 흐릿한 콜로니는 GFP 불활성 돌연변이가 포함된 플라스미드를 나타냅니다.

이 그림은 100 base pair 간격으로 타겟 플라스미드의 중립 서열 전체에 걸쳐 나타난 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 돌연변이는 플라스미드 서열 전체에서 발생하지만, 복제 기점(origin of replication)에 가장 가까운 곳에서 가장 높은 빈도로 발생함에 유의하십시오. 여기에서는 약물 농도 구배에 따른 돌연변이체의 성장이 표시되어 있습니다.

구배의 상단을 향해 성장한 거리는 돌연변이체들 사이의 차별적인 약물 내성 프로파일을 나타냅니다. 본 예시에서는 약물 선택 구배를 사용하여 메틸 메탄 설포네이트에 대한 내성이 증가한 돌연변이체를 찾기 위해 인간 산화적 탈메틸화 효소 ABH two의 플라스미드 라이브러리를 스크리닝하였습니다. 돌연변이 유발 프로토콜을 2회 및 4회 반복하여 생성된 이러한 라이브러리를 모체 야생형 및 공벡터와 비교하여 보여줍니다.

흰색 선은 개별 돌연변이 콜로니를 분리한 임계값을 나타냅니다. 추가적인 표현형 분석을 위해, 이전에 low fidelity P one mutagenesis 및 astri 및 m 선택법을 사용하여 식별된 beta-lactamase 돌연변이체인 R 1 64 H 및 E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R을 0.4 µg/mL 및 4 µg/mL Cefotaxime 농도 구배에서 보여줍니다. cefotaxime에 대한 보호 효과는 extended spectrum beta-lactamase 활성을 나타냅니다.

야생형 베타-락타마제(beta-lactamase) 효소는 공벡터(empty vector)를 발현하는 세포와 비교했을 때 아무런 보호 효과를 제공하지 않는다는 점에 유의하십시오. 따라서 이러한 돌연변이체들은 적응 또는 새로운 생화학적 활성의 진화를 나타냅니다. 본 연구에서는 이러한 새로운 생화학적 활성을 생성하기 위해 돌연변이 유발과 기능적 선택을 결합한 강력한 방법을 제시하였습니다.

기능적 선택은 약물 선택 또는 유전적 상보성을 통해 얻을 수 있으며, 이는 방대한 유전적 다양성을 생성할 수 있는 능력을 활용하는 것입니다. 기존 단백질 활성을 최적화하거나 부위 특이적 발병 기전을 연구하기 위해서는 발병 기전이 특정 서열로 제한되어야 할 수도 있습니다. 이러한 작업은 클로닝을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.

또한, 시그니처 공격(signature attack) 또는 돌연변이 풋프린트(mutational footprint)를 얻기 위해 돌연변이 유발을 기능적 선택 과정과 분리하여 수행할 수 있습니다.