효모 콜로니 임베딩 방법

이 절차의 전반적인 목표는 효모 콜로니를 임베딩하는 것입니다. 이는 먼저 한천 배지에서 콜로니와 그 아래의 한천을 제거하여, 이를 녹은 한천 방울 위에 올린 후 빠르게 더 많은 녹은 한천으로 덮음으로써 달성됩니다. 그다음, 몰드에 들어갈 수 있을 만큼 크기를 줄이기 위해 콜로니 주변의 과잉 한천을 다듬어 냅니다.

그 후 AER 임베딩 콜로니를 고정, 염색, 탈수하고 최종적으로 spurs 레진으로 침투시킵니다. 해당 블록을 추가 spurs 레진이 담긴 몰드에 넣고 경화될 때까지 배양한 후 절편을 제작합니다. 최종적으로 광학 현미경 또는 전자 현미경을 통해 효모 콜로니 내 세포 유형의 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

주사전자현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 군집의 내부 구조를 파악할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 군집 내 세포 유형의 분포와 같이 미생물 발달 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 croce CAC 군집의 구조에 대한 통찰을 제공하였으나, 다른 미생물에도 적용 가능할 것으로 보입니다.

군락(colony)의 취급 및 임베딩은 서면 프로토콜만으로는 학습하기 어려울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 방법은 포자가 군락 내에 균일하게 분포하지 않는다는 점을 시사한 2002년의 유전 데이터 발표에서 영감을 얻었습니다. 저희는 Fin 연구실의 Engelberg가 개발한 군락 절편 제작 방법을 응용하였습니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 먼저 Wild S visi 효모를 30 °C의 auger 플레이트에서 약 300개의 콜로니가 생성될 때까지 배양하십시오. 좁은 스파툴라를 사용하여 지름 1~2 mm의 콜로니를 플레이트에서 하나씩 제거합니다.

그 다음, 1 mL 피펫 팁을 사용하여 42 °C의 2% agar를 현미경 슬라이드 위에 몇 방울 떨어뜨리고, AER이 굳기 전에 즉시 콜로니를 agar 면이 위로 향하게 하여 올려놓습니다. 콜로니 위에 agar를 몇 방울 더 추가하고 agar가 굳을 때까지 기다려, 콜로니의 상단을 포함한 전체가 agar에 완전히 둘러싸이도록 합니다. 이후의 모든 프로토콜 단계에서는 면도날을 사용합니다.

콜로니 주변의 AER을 다듬고, 콜로니가 포함된 AER 블록을 2% 파라포름알데히드와 2% 글루타르알데히드 고정액이 들어 있는 3.5 mL 붕규산 유리 스크류 캡 바이알에 넣습니다. 건조를 방지하기 위해 콜로니는 하나씩 처리해야 하지만, 최대 10개의 콜로니를 동일한 바이알에 넣을 수 있습니다. 콜로니를 4°C에서 7일 동안 보관합니다.

1주일 후, 고정액을 제거하고 약 1.5밀리리터의 0.15몰 sodium carbonate(pH 7.2)를 사용하여 agri colonies를 2회 세척하며, 각 세척 후에는 흔들지 않은 상태로 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 이후 이 세척 과정을 2회 더 반복합니다.

100 mM mono potassium phosphate와 10 mM magnesium chloride로 구성된 pH 6.0의 1X OS buffer 1.5 mL를 사용하여, 각 세척 후 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 동일한 바이알을 사용하여 여기와 본 프로토콜의 서술 부분에 명시된 오스뮴 처리 및 세척 과정을 수행합니다. 그 후, 다음 날 이른 아침에 다시 동일한 바이알을 사용하여 여기와 동반된 서술 프로토콜에 명시된 단계적 탈수 과정을 수행합니다.

여기에 표시된 방법과 동반된 서면 프로토콜에 따라 spurs 시약을 준비하십시오. 즉시 agri block을 상온의 100% 에탄올 1.5 milliliters로 10분씩 5회 세척하십시오. 마지막 에탄올 세척 후에는 agri block이 잠겨 있을 정도로만 에탄올을 제거하십시오.

파스퇴르 피펫을 사용하여 약 0.5 milliliters의 spurs 시약을 바이알에 넣고 저속 휠에서 15분 동안 회전시킵니다. 회전 후 상온에서 바이알을 30분 동안 그대로 둡니다. 그 다음, 용액을 완전히 제거합니다.

그런 다음 agri 블록이 잠길 정도로 spurs 시약 1.5 milliliters를 첨가합니다. 다시 바이알을 휠 위에 올려 상온에서 15분 동안 회전시키고 30분 동안 그대로 둡니다. 이 세척 과정을 반복합니다.

이 과정을 3회 더 반복하십시오. 마지막 30분이 지난 후, spurs 시약을 제거하고 새로운 spurs 시약을 추가하여 블록을 덮어줍니다. agri 블록을 실온에서 4시간 동안 그대로 둡니다.

스퍼(spurs) 시약을 교체하고 하룻밤 동안 회전시키십시오. 다음 날 아침에 스퍼 시약을 다시 교체하고 다음 날까지 바이알을 계속 회전시킵니다. 그다음 날 아침, 번호가 매겨진 실리콘 몰드의 바닥이 살짝 잠길 정도로 스퍼 시약을 넣으십시오.

다음으로 agri 블록을 몰드에 넣고 60 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 몰드에 spur와 시약을 더 채워 넣고 60 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 섹셔닝을 위해 몰드에서 블록을 꺼냅니다.

Wild S Visia 효모 군집의 중심부를 절단한 광학 현미경 사진의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이 효모는 나무 삼출물에서 분리된 야생형 균주입니다. 군집은 절단 전 YNA 배지에서 6일 동안 배양되었습니다.

이 이미지에서 asai, pseudo hyphy 및 난형 효모(ovoid yeast)를 쉽게 구별할 수 있으며, 하부 한천으로 침투하는 군락 부위도 분명하게 나타납니다. 빈 화살표는 대표적인 asai를, 채워진 화살표는 대표적인 난형 영양 세포(ovoid vegetative cells)를, 채워진 화살표촉은 연장된 세포 체인과 si를 나타냅니다. 이 이미지는 실험실 효모 균주 SH 1 0 2 0 및 W 3 0 3의 박절편 전자현미경 사진의 예시입니다.배경.

절편 제작 전, 콜로니를 YNA 배지에서 6일 동안 배양하였습니다. 이미지는 포자 형성 세포의 빈도가 높은 콜로니 영역을 보여줍니다. 화살표는 포자벽의 이중층 구조를 나타냅니다.

파트 A에서는 4일 된 콜로니의 단면을 보여주며, 파트 B의 이미지 위에는 15개의 직사각형으로 구성된 그리드가 겹쳐져 있습니다. 각 직사각형 내 포자 관련 세포의 빈도는 파트 A에 표시된 15개의 직사각형에 대응하는 15개의 막대로 그래프화되었습니다. 데이터는 독립적인 4일 된 콜로니 4개의 평균 및 표준 오차입니다. 파트 C에서는 독립적인 8일 된 콜로니 4개의 평균 및 표준 오차가 표시되어 있습니다. 이 기술을 숙달하면, 전일 작업 하루와 1~3시간 정도 소요되는 작업 며칠을 포함하여 2주 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 블록이 마르지 않도록 용액을 즉시 추가하는 것이 중요합니다.

면역 전자 현미경법과 같은 다른 방법들을 사용하여 발달 후 특정 단백질을 발현하는 세포들의 분포를 결정할 수 있을 것입니다. 이 기술을 통해 우리는 포자 형성 세포의 패턴뿐만 아니라 croce CCI 콜로니 내의 가성 균사 세포의 패턴도 관찰할 수 있었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 절편 제작을 위해 효모 콜로니를 포매하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

본 프로토콜에 사용되는 많은 현미경 시약들이 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 반드시 흄 후드를 사용하고, 보호복을 착용하며, 시약을 적절하게 폐기하시기 바랍니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.