구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

치아 표면에 형성된 바이오필름은 매우 복잡한 구조를 가지고 있습니다. 미생물 군집은 세포외 기질 내에 얽혀 있으며, 지속적인 환경적 변화에 노출됩니다. 본 연구의 전반적인 목표는 새로운 형광 이미징 기술과 데이터 처리 및 분석을 위한 맞춤형 소프트웨어를 결합함으로써, 구강 바이오필름의 복잡한 특성을 고려하여 구조적 및 분자적 연구를 용이하게 하도록 설계된 분석 툴박스의 두 가지 특정 구성 요소를 제시하는 것입니다.

이는 먼저 EPS와 박테리아를 동시에 시각화하는 새로운 공초점 이미징 접근법을 포함하여, 바이오필름, 전사체 및 구조 분석을 위한 특정 분석법을 선택함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 바이오 분석으로부터 원시 데이터를 수집하는 것입니다. 세 번째 단계는 공동 국소화 분석을 위해 새로 개발된 duo stat을 포함한 특정 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 처리하는 것입니다.

마지막 단계는 microarray 데이터 마이닝 및 정리 소프트웨어인 microarray data visualizer(MDV)를 사용하여 프로세스 데이터를 분석하는 것입니다. 결과적으로, 당사만의 독특하게 통합된 분석 툴박스를 활용하여 복잡한 식단 및 호스트 미생물 상호작용에 반응하여 구강 병원균의 전사체와 바이오필름의 구조가 어떻게 변화하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이를 통해 더욱 포괄적인 바이오필름 분석과 데이터 해석이 가능합니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 의료 센터(University of Rochester Medical Center) 구강 생물학 센터의 부교수인 Michelle Kuh입니다.

오늘은 바이오필름 분석을 위한 분석 툴박스를 소개합니다. 이 툴박스는 바이오필름 세포가 어떻게 구조화되어 있는지, 세포외 기질과 어떻게 배열되어 있는지, 그리고 전사체 수준에서 복잡한 환경적 도전 과제에 어떻게 반응하는지와 같은 바이오필름 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 제 이름은 Jean이며, Dr.Ks 연구실의 박사후 연구원입니다.

오늘은 저희 툴박스의 이미징 부분을 시연하겠습니다. 안녕하세요, 저는 Dr.Ks 연구실의 연구 조교수 Aise Klein입니다.

오늘은 마이크로레이(microray) 데이터 분석을 위한 MDV 소프트웨어를 소개하겠습니다. 본 절차에서는 바이오필름을 배양하기 위한 치아 표면 대용물로 타액이 코팅된 하이드록시아파타이트 디스크를 사용합니다. 먼저, 24웰 플레이트의 각 웰에 S. mutans가 접종된 배양액 2.8 milliliters를 첨가하고, 플레이트가 빛에 노출되지 않도록 보호하면서 각 웰에 최종 농도가 1 micromolar가 되도록 덱스트린 결합 LOR 6 47 염료를 첨가한 후, 파이펫으로 여러 번 빨아들였다가 내뱉어 염료가 배양액에 잘 섞이도록 합니다.

다음으로, 멸균 집게를 사용하여 멸균된 타액 코팅 하이드록시아파타이트 디스크를 멸균된 AB 버퍼에 두 번 담가 세척함으로써 과잉 타액이나 결합되지 않은 타액 성분을 제거합니다. 그런 다음 디스크를 염료가 첨가된 배양 배지에 수직으로 세워 배치하고, 각 디스크가 완전히 잠겼는지 확인합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 37 °C, 5% CO2 배양기에서 20시간 동안 배양하여 바이오필름이 형성되고 접합된 텍스처가 박테리아 세포에서 생성된 엑소다당류에 통합되도록 합니다.

먼저 박테리아 세포를 라벨링하기 위해, 24웰 플레이트의 각 웰에 2.8 milliliters의 멸균 milli Q water를 준비합니다. 각 웰에 cyto nine dye 1.5 microliters를 추가하여 최종 농도가 one micromolar가 되게 하고, 플레이트를 빛으로부터 차단합니다. 바이오필름이 형성되면, 디스크가 담긴 플레이트를 인큐베이터 딥에서 꺼냅니다.

각 디스크를 0.89% sodium chloride 용액으로 세척합니다. 그 후, cyto nine 염색액이 담긴 새 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 상온에서 30분 동안 배양합니다.

세포 염색이 완료되면, 이전과 동일하게 생물막을 세척하고 염화나트륨에 담급니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 와이어에서 생물막을 떼어내 염화나트륨이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시를 알루미늄 호일로 감쌉니다.

이제 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 공초점 현미경으로 바이오필름을 시각화할 준비가 되었습니다. 각 바이오필름의 무작위로 선택된 5~10개 위치를 스캔하고, 각 위치에서 Z-시리즈를 생성합니다. 3D 재구성을 위해 공초점 이미지를 열고 미러 소프트웨어를 사용하여 처리합니다.

Amira 프로그램을 사용하여 생성한 공초점 이미지의 3차원 렌더링은 시연된 절차를 통해 비활성 표면에 형성된 S 돌연변이체의 바이오필름을 보여줍니다. 세균 세포와 미세 군집은 녹색으로 나타나며, 엑소다당류를 포함하는 바이오필름 매트릭스 내에 매몰되어 있습니다. 빨간색으로는 선택 영역의 확대 뷰를 생성할 수 있으며, 이는 미세 규모에서의 특정 세균 EPS 구조적 관계를 보여줍니다.

duos stat 프로그램을 사용하여 박테리아와 엑소다당류(exo polysaccharides)와 같은 개별 바이오필름 구성 성분의 공국소화(colocalization) 정도를 정량화합니다. 먼저, MATLAB 버전 5.1에서 새로 개발된 duo stat의 경로를 설정하고, 두 바이오필름 구성 성분의 Z-시리즈 이미지가 포함된 이미지 폴더를 엽니다. 그다음, 상관 관계를 분석할 두 채널을 선택합니다.

두 이미지 스택은 모든 차원에서 픽셀 크기가 동일해야 하며, 각 스택의 이미지 수도 동일해야 합니다. 각 채널의 임계값을 설정하고 소프트웨어 인터페이스의 지침에 따라 데이터를 데이터 처리 파일에 입력하여 분석하십시오. 이 그림은 duo stack이 박테리아와 DBS 사이의 공간적 관계를 어떻게 정량적으로 해석하는지 보여줍니다.

바이오필름 내에서 Duo stack은 여기의 세균을 나타내는 녹색 선과 EPS를 나타내는 빨간색 선에서 볼 수 있듯이, 디스크 표면부터 액상까지 세균과 DPS의 수직 분포를 계산합니다. 또한 바이오필름 두께 전반에 걸친 세균과 DPS의 공국소화(colocalization)를 계산합니다. 노란색 선에서 보여지듯, 데이터는 바이오필름 깊이에 따라 세균보다 EPS의 비율이 더 높음을 보여주며, 대부분의 세균 세포는 특히 중간층부터 상층부까지 EPS와 연관되어 있습니다. 3D 렌더링을 제공하는 Duo stat은 바이오필름 내 세균과 DPS의 구조적 조직 및 상호작용에 대한 향상된 이해를 제공합니다.

바이오필름으로부터 고품질의 RNA를 얻기 위해, 2007년에 발표된 Curian KU의 논문에 기술된 바이오필름 특이적 프로토콜에 따라 RNA 추출을 수행할 것을 권장합니다. 해당 학술지에서는 cDNA 마이크로어레이 준비 및 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 분석 생화학 표준 프로토콜이 사용되었습니다. 마이크로어레이 실험으로 생성된 대규모 데이터 세트의 분석을 용이하게 하기 위해, 당사는 데이터 마이닝 및 조직화 소프트웨어인 마이크로어레이 데이터 비주얼라이저(microarray data visualizer 또는 MDV)를 설계하였으며, 이는 www.oralgen.anl.gov에서 온라인으로 이용 가능합니다.

데이터를 MDV에 제출하기 전, 온라인에서 제공되는 BRB array tool 소프트웨어를 사용하여 클래스 비교를 위한 컷오프 P 값을 0.001로 설정하고 무작위 분산 모델을 적용한 대응 표본 T-검정(paired T-test)과 같은 통계 분석을 수행하십시오. 본 예시에서는 세 가지 서로 다른 당 농도와 네 가지 시점에서 배양된 s mutton의 바이오필름 분석을 수행하였습니다. 다음과 같은 세 가지 BRB 파일을 생성하여 대응 비교를 수행하였습니다: 조건 A는 0.5%sucrose plus 1%starch 대 1%sucrose, 조건 B는 0.5%sucrose plus 1%starch 대 0.5%sucrose, 조건 C는 0.5%sucrose 대 1%sucrose입니다.

이 패널은 BRB 어레이 툴을 이용한 표준 클래스 비교를 통해 각 조건과 시점별로 차별적으로 발현된 것으로 검출된 유전자의 수를 나타내며, 그 결과 BRB raw data로 명명된 다수의 유전자 목록이 생성됩니다. MDV 시연을 위해, Excel을 사용하여 30시간 시점에 집중해 보겠습니다. BRB raw data를 MDV 탭 구분 텍스트 파일로 변환하십시오.

유전자 로커스 탭 번호와 함께 표시되는 모든 문자를 반드시 제거하십시오. 예를 들어, SMU dot 1432 C라는 이름에서 문자 C를 삭제하십시오. MDV를 엽니다. 파일 메뉴를 열고 annotation source(주석 소스) 선택을 클릭합니다. 대화 상자가 나타나면 flat file(플랫 파일) 옵션을 선택하십시오.

찾아보기 버튼을 사용하여 유전자 온톨로지 번호 경로 기능 분류 데이터 및 유전자 이름에 대한 주석이 포함된 파일을 선택하십시오. 파일 메뉴로 이동하여 MDV 형식으로 변환된 각 파일을 가져오십시오. 각 파일은 하나의 실험 조건을 나타냅니다.

실험 조건 A, B, C 각각에서 발현된 유전자를 비교합니다. 이 예시에서는 벤 다이어그램 기능을 사용합니다. 본 시연에서는 설탕과 전분의 복합적인 영향과 독특하게 연관된 차별 발현 유전자에 초점을 맞춥니다. 벤 다이어그램 기반 기능은 이러한 서로 다른 조건 하에서 발현된 고유 유전자와 공유 유전자의 수를 시각화하는 데 사용되며, 추가 분석을 위해 선택할 유전자를 식별하는 데 도움을 줍니다.

여기서는 회색으로 표시된 C에서 검출된 유전자를 제외하고, 조건 A 또는 B에서만 독특하게 차등 발현된 유전자만을 선택합니다. MDV는 분석 대상 유전자의 총 수를 크게 줄이는 동시에, 해당 실험 사례와 관련이 없는 유전자들을 필터링했습니다. 파일 메뉴에서 내보내기 옵션을 선택하여 데이터를 저장하십시오.

탭으로 구분된 파일이므로, 해당 파일들을 Excel에서 열어 데이터 출력을 정리하고 원하는 그래픽 디스플레이로 변환할 수 있습니다. Excel에서의 데이터 정리를 통해 MDV 출력의 그래픽 디스플레이가 가능해집니다. 이 그래프는 바이오필름 발달의 서로 다른 단계에서 전분과 자당의 조합에 의해 영향을 받는 고유한 기능적 유전자 하위 집합의 차등 발현에 대한 개요를 보여줍니다.

S 돌연변이체의 전사체에 미치는 영향은 바이오필름 형성 30시간째에 다른 시점보다 더 두드러지게 나타납니다. 이러한 결과는 유전자 선택 및 추가 검증 과정을 용이하게 한 시간적 효과를 고려했을 때, 우리의 작업 가설과 관련이 있는 특정 기능적 유전자 하위 집합을 정확하게 식별하는 데 도움이 되었습니다. 이 절차에 이어, 바이오필름 내 생물체의 구체적인 생리학적 및 대사적 반응은 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 생화학적 및 단백질체학적 방법 또한 수행될 수 있습니다.

이러한 포괄적이고 통합적인 분석은 매우 동적이고 복잡한 환경인 구강 내 공간에서 바이오필름이 병원성을 어떻게 조절하는지 더욱 깊이 이해하는 데 분명 도움이 될 것입니다. 더 자세한 내용은 이 비디오 논문에 첨부된 PDF 파일을 확인하시기 바랍니다.