Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

다음 절차의 전반적인 목표는 특정 접착성 미세 패턴에서 구현된 세포 구조 및 위치의 표준화가 어떻게 이미지 획득의 자동화를 용이하게 하고, 기존의 유리 커버슬립 지지체에서는 불가능한 약물 효과의 민감하고 견고한 정량화를 포함한 단순한 이미지 처리를 가능하게 하는지 보여주는 것입니다. 이는 L자형 SI three 표식 미세 패턴이 있는 SI two 칩에 heli 세포를 시딩함으로써 달성됩니다. 세포는 삼각형 모양을 형성하며 L자의 양 끝을 가로지르는 주요 스트레스 섬유를 구축합니다. 이후 패턴 세포를 lebos statin과 함께 배양하거나 처리하지 않은 상태로 둔 다음, 고정 및 염색하여 액틴 세포골격과 핵을 시각화합니다.

그 후 마이크로패턴 세포의 이미지를 획득하고 cell ref 매크로를 사용하여 처리함으로써 분석을 위한 이미지 스택을 생성하며, hypotenuse 매크로를 사용하여 표현형을 정량화합니다. 결과적으로, 표준 세포 배양 조건에서는 검출되지 않는 저용량 BLEs statin이 마이크로패턴 HELOC 세포에 미치는 유의미한 효과를 확인할 수 있습니다. 안녕하세요, 환영합니다.

오늘은 세포 분석을 위한 접착성 마이크로 패턴의 사용 방법을 설명하는 실험 프로토콜을 안내해 드리고, 이러한 접착성 마이크로 패턴 상에서 매우 낮은 용량의 약물을 용이하게 정량화할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 제시하고자 합니다. 이 마이크로 패턴을 처음 보시면, 세포 분석 중 이미지 캡처 시 발생하는 변동성 문제를 어떻게 해결할 수 있는지 즉시 이해하실 수 있을 것입니다. 마이크로 어레이와 매우 유사하게 세포들이 배열되어 있기 때문에, 현미경 스테이지를 세포에서 세포로 쉽게 이동시키며 단계별로 이미지를 캡처할 수 있기 때문입니다.

하지만 이것이 마이크로 패턴이 제공하는 유일한 장점은 아닙니다. 사실 십자형이나 Y자형과 같은 특정 전형적인 마이크로 패턴에서는 내부 세포 구조를 표준화할 수 있기 때문에 훨씬 더 많은 개선 사항을 제공합니다. 즉, 세포 소기관, 방추사, 세포골격 및 다양한 단백질 네트워크가 세포마다 동일한 위치에 있거나 동일한 방향으로 배열되어, 이러한 특정 패턴에서 약물이 미치는 영향을 훨씬 더 쉽게 예측하고 정량화할 수 있습니다. 이는 일반적인 페트리 접시나 마이크로플레이트에서 수행하는 방식과는 상당히 상반되는 개념으로 보일 수 있습니다.

물론 일반적으로 세포들이 돌아다니며 다양한 형태를 띠는 모습을 자주 보게 됩니다. 반면 접착성 마이크로 패턴 위에서는 모든 세포가 이 접착성 마이크로 패턴에 반응하여 동일한 방식으로 구조를 조직하기 때문에 모두 비슷하게 보이기 시작할 것입니다. 이것이 사실 다소 인위적으로 보일 수 있지만, 자세히 생각해보면 페트리 접시가 훨씬 더 인위적이지 않을까요?

조직 내에서 세포는 인접한 세포뿐만 아니라 세포외 기질에 의해 제약을 받기 때문입니다. 따라서 세포는 세포 구조를 결정짓는 많은 공간적 정보를 받게 됩니다. 그리고 이것이 바로 우리가 마이크로 패턴을 이용해 구현하고자 하는 것입니다.

우리는 이러한 공간 정보를 세포에 복원하고 있으며, 모든 세포는 이에 반응하여 동일한 방식으로 조직화되고 있습니다. 이제 모든 세포가 유사하게 보이므로 '참조 세포(reference cell)'라는 개념을 도입할 수 있는데, 이는 모든 이미지를 평균화하여 특정 조건에서 세포가 어떻게 보이는지를 진정으로 대표하는 단일 이미지를 얻을 수 있음을 의미합니다. 그런 다음 약물을 처리하고 해당 참조 세포를 다시 관찰함으로써, 그 약물에 반응하여 세포의 형태나 조직이 어떻게 변형되었는지 확인할 수 있습니다.

Situ two 칩 두 개를 6-well 플레이트의 독립된 웰 두 개에 각각 배치하며, 이때 situ two 로고가 읽을 수 있는 방향인지 확인하십시오. 본 실험에 사용되는 situ two 칩은 FibroGen SI three로 염색된 마이크로 패턴이 형성되어 있으며, 사용 전까지 암소에 보관해야 합니다. 약 80% confluency에 도달한 HeLa 세포를 트립신으로 수집하고, 현미경 하에서 세포가 적절히 단일 세포로 분리되었는지 확인하십시오. 300 ×g에서 4분간 원심 분리한 후 세포를 부드럽게 재현탁하고, 세포 수를 측정하여 15,000 cells/mL 농도로 희석하십시오.

불완전 D-M-E-M-F 12 배양 배지에 웰당 60,000개의 세포를 분주합니다. 배지 내에 회전 운동이 발생하여 세포가 중앙으로 집중되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 최대한 움직이지 않아야 합니다. 후드 내에서 10분 동안 세포를 침강시킨 후, 세포 배양기로 옮깁니다.

세포 배양기 내에서 10~20분 정도 지나면 세포가 부착되기 시작하며, 10분 후부터 현미경으로 세포의 부착 여부를 정기적으로 확인하십시오. 세포 배양액을 교체하고, 다음 절차를 4회 반복하여 과잉 세포를 제거합니다. 플레이트를 평평하게 유지한 상태에서 웰의 측면으로부터 배양액을 조심스럽게 흡입하십시오.

칩이 마르는 것을 방지하기 위해 충분한 양의 배지를 유지하도록 주의하십시오. 4 mL의 PBS를 첨가하고 칩의 중앙부터 흡입하십시오. 그런 다음 이전과 마찬가지로 웰의 측면으로 이동하여 PBS의 대부분을 흡입한 후, 현미경으로 부유 세포가 있는지 확인하십시오.

부유 세포가 많이 남아 있는 경우, 세척 과정을 반복하십시오. 세포 수가 매우 적은 경우, PBS의 일부를 흡입하여 제거하고 2 mL의 신선한 배지로 교체한 후, 신선한 배지 4 mL를 두 차례 추가하십시오. 세포가 충분히 퍼질 수 있도록 세포 배양기에서 3시간 동안 배양하십시오.

이 방법을 사용하면 마이크로 패턴의 10~30%가 단일 세포에 의해 점유되며, 나머지 패턴은 비어 있거나 여러 세포에 의해 점유됩니다. 세포에 BLEs statin을 처리하려면 17 mM 약물 스톡 용액을 0.1% DMSO가 포함된 4 mL 배지로 희석하여 최종 농도를 5 µM로 맞춥니다. 대조군의 경우 0.1% DMSO만 포함된 배지를 준비합니다. 칩이 마르는 것을 방지하기 위해 세포 배지를 흡입한 후 즉시 BLEs statin 또는 대조군 용액으로 교체합니다.

세포를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 세포골격 완충액을 준비합니다. 2 mL의 cb에 sucrose 1 g을 첨가합니다.

이는 세포 내부 구조를 보존하는 데 도움이 됩니다. 5% PFA 4 mL에 CB sucrose 1 mL를 혼합합니다. CB sucrose 용액에 포함된 PFA 2 mL를 추가합니다.

새 6-웰 플레이트의 두 웰에 준비합니다. 세포를 고정하려면 핀셋으로 CY 2 칩을 집어 CB sucrose 용액 내의 PFA 2 mL가 들어 있는 6-웰 플레이트에 넣습니다. 상온에서 10분 동안 세포를 배양한 후, PFA를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 100 mM ammonium chloride 2 mL로 세포를 10분 동안 세척합니다.

잔류 PFA 가교 활성을 억제하기 위해, 0.1% Triton X 100이 포함된 PBS 2 mL를 첨가하여 3분 동안 세포를 투과화하고, PBS로 2회 세척한 후, 1.5% BSA가 포함된 PBS 내에서 1:2000으로 희석한 ZI 결합 phalloidin 2 mL로 액틴 필라멘트를 염색하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, 2 mL의 PBS로 세포를 1회 세척합니다. 이어서, 핵을 염색합니다.

1 mg/mL 농도로 PBS에 희석된 용액 2 mL를 첨가하고 상온에서 3분 동안 배양합니다. 2 mL의 PBS로 2회 세척합니다. 25~30 µL의 al과 같은 마운팅 용액을 사용하여 2개의 칩을 표준 슬라이드에 마운팅합니다.

세 가지 파장의 이미지를 획득하기 위해, Metamorph 이미징 소프트웨어와 NIK icon eclipse T 현미경을 사용합니다. 이 현미경에는 CCD Hema Matsu 카메라와 intens lite 수은 파이버 조명 장치가 장착되어 있습니다. 먼저 20배 배율을 선택하십시오.

다음으로 메뉴 표시줄에서 다차원 획득(multidimensional acquisition)을 엽니다. 실험의 다양한 매개변수를 설정하십시오. 먼저 데이터를 저장할 위치를 지정합니다.

파장의 수를 3개로 설정하고, SI 3파장을 선택한 후, 카메라 시야의 중앙에 12개의 마이크로 패턴이 오도록 커버슬립 슬라이드를 배치하십시오. 시야당 시각화되는 마이크로 패턴의 수는 카메라 및 대물렌즈 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 각 파장에 대한 노출 시간과 오토포커스를 설정하십시오.

PS three의 경우, 다차원 획득(multi-dimensional acquisition)을 수행하는 저널을 생성하고 이를 MDA jnl로 저장합니다. 각 이미지에 12개의 마이크로 패턴이 포함된 총 24장의 이미지를 획득하기 위해 스캔 스테이지 기능을 엽니다. 설정 저널에 열 6개와 행 4개를 입력하고, x 단계 크기는 -400 micron, y 단계 크기는 300 micron으로 설정하여 실행합니다. MDA jnl 저널을 업로드한 후 scan을 눌러 3가지 파장에서의 24장 이미지 자동 획득을 시작합니다.

이 비디오에서는 L자형 마이크로 패턴을 사용하여 단일 주요 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)의 형성을 유도함으로써, 세포의 부착되지 않은 부분을 지지하게 하고, 평면 피브로넥틴(fibronectin) 위에 놓인 세포와 비교하여 BLEs statin이 세포에 미치는 영향을 시각화하고 측정하는 과정을 단순화합니다. 자동 이미지 처리 및 분석을 위해, 오픈 소스 프로그램인 ImageJ용으로 작성된 두 가지 맞춤형 매크로를 설명합니다. 첫 번째 매크로는 원본 이미지 스택에서 개별 세포를 추출하고 참조 세포를 생성하며, 두 번째 매크로는 세포막의 붕괴 정도를 측정합니다.

첫 번째 단계는 원본 이미지에서 개별 세포를 분할하는 것입니다. 형광 표지된 마이크로 패턴 이미지를 사용하여 마이크로 패턴을 중심으로 한 영역을 추출하며, 이는 파장별 이미지로 크롭된 후 각 파장별 스택으로 다시 재조립됩니다. 단일 세포가 포함된 마이크로 패턴을 선택하기 위해, 매크로가 이미지당 핵의 수를 감지하여 핵이 하나보다 많거나 없는 경우를 모든 스택에서 제거합니다.

마지막으로, Image J 플러그인인 multi-stack reg를 사용하여 수집된 모든 이미지와 모든 채널을 마이크로패턴 위치를 기준으로 다시 정렬합니다. 이 단계를 통해 개별 이미지의 라인 스택이 생성되며, 이는 단일 세포 분석이나 참조 세포 생성에 사용될 수 있습니다. Image J에서 참조 세포는 스택에서 필터링 및 정렬된 이미지들의 투영(projection)을 통해 구축됩니다.

여러 가지 투영 방법을 적용할 수 있으나, 일반적으로 이미지 스택의 이상치를 제거하기 위해 중앙값 투영(median projection)이 선택됩니다. 참조 셀(reference cell)은 마이크로패턴 셀에서만 얻을 수 있는 표현 및 이미지 분석을 위한 독특하고 유용한 도구입니다. 이를 용이하게 검토하기 위해, 단색 이미지를 부호화된 빈도 맵으로 변환하는 룩업 테이블(lookup table) 또는 LUT가 적용됩니다.

BLEs의 스타틴 효과를 규명하기 위해, 두 번째 Image J 매크로를 사용하여 세포의 강성(rigidity)과 붕괴(collapse)를 분석하였습니다. 간단히 설명하면, L 마이크로 패턴의 임계값 이미지를 사용하여 세포 삼각형 모양의 이론적 빗변을 정의합니다. 그다음, 액틴 염색 이미지의 임계값 처리를 수행하여 세포 모양을 정의합니다.

이후 이론적인 빗변과 실제 오목한 세포막 사이의 면적 차이를 측정하며, 이론적인 빗변 아래에 면적이 형성된 세포는 붕괴된 것으로 간주합니다. 5 µM BLEs statin의 영향은 처리군과 대조군에서 붕괴된 세포의 수를 비교하여 특성화하였습니다. BLEs statin으로 처리하거나 처리하지 않은 L 마이크로패턴 세포의 전형적인 이미지가 제시되어 있으며, 세포는 고정 후 마이크로패턴을 염색하였습니다.

액틴과 핵이 각각 빨간색, 녹색, 파란색으로 표시되었습니다. 대조군 조건과 비교하여 BLEs statin이 세포 모양에 미치는 영향에 주목하십시오. 평면 피브로넥틴 상에서 BLEs statin 또는 대조군과 함께 배양한 후의 대표적인 세포들이 여기에 표시되어 있습니다.

세포를 고정하고 염색하였으며, 액틴과 핵은 각각 녹색과 청색으로 나타납니다. 처리군과 대조군 조건 사이의 유사성에 주목하십시오. BLEs statin으로 처리한 세포 또는 처리하지 않은 대조군 세포로부터 얻은 참조 세포의 전형적인 이미지가 표시되어 있습니다.

연구 대상의 표현형을 쉽게 관찰할 수 있는 이 접근법의 잠재력에 주목하십시오. 다음은 매크로 하이포테뉴스(macro hypotenuse)를 사용하여 BLEs statin이 세포에 미치는 영향을 분석한 예시입니다. 대조군 세포의 25%가 수축된 반면, 5 µM BLEs statin 처리 세포에서는 이 비율이 3배 증가한 75%로 나타났으며, 이는 약화된 actinin 수축 네트워크를 반영합니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 접착성 마이크로 패턴이 고함량 분석(high content analysis)의 여러 병목 현상을 어떻게 해결하는지에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 첫째, 접착성 마이크로 패턴을 사용하면 이미지 캡처 처리 분석이 훨씬 더 간편해집니다. 둘째, 세포의 형태와 행동을 표준화함으로써 세포 간 변동성을 줄일 수 있기 때문에, 매우 낮은 용량의 약물이 나타내는 아주 미세한 효과까지 검출할 수 있습니다.

마지막으로, 세포 분석에서 좋은 결과를 얻기 위해 통상적으로 수천 개의 세포가 필요한 것과 비교하여, 당사의 기준 세포를 사용하면 수십 개의 세포만으로도 견고하고 유의미한 결과를 얻을 수 있습니다.