바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

이 절차의 전반적인 목표는 거대분자와 리간드의 결합을 설명하는 적절한 물리적 모델을 식별하고, 그와 관련된 열역학적 파라미터를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 광범위한 투석을 통해 거대분자의 스톡 용액을 준비함으로써 달성됩니다. 그 다음, 관심 대상인 리간드를 최종 투석 버퍼에 녹이고, 두 번째 단계에서 모든 구성 성분의 농도를 결정합니다.

거대분자와 리간드 시료를 여러 가지 다른 농도로 주의 깊게 희석합니다. 다음으로, 리간드와 단백질 모두를 여러 농도로 설정하여 일련의 등온 적정 열량 측정법(isothermal titration calorimetry, ITC) 실험을 수행하며, 절차의 마지막 단계에서 일련의 ITC 등온선을 생성합니다. 일련의 실험 결과에 대해 다양한 물리적 모델을 사용하여 전역 분석(global analysis)을 수행하며, 전체적으로 가장 잘 일치하는 모델을 정답으로 식별합니다.

오늘은 단백질 분자가 리간드와 어떻게 결합하는지와 같은 생물물리학적 질문에 답하는 데 도움이 되고, 엔트로피, 엔탈피 및 결합 상수와 같은 결합 파라미터의 정확한 측정값을 제공할 수 있는 방법을 보여드리겠습니다. 본 프로토콜을 시작하기 전에, 관심 단백질을 정제하십시오. 본 시연에서 사용된 거대분자는 immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I 또는 a C six prime one I입니다. 우선, 4 L의 투석 버퍼를 준비하여 4 °C로 냉각하십시오. 다음으로, 소량의 거대분자 용액을 투석하십시오.

이 경우, 4°C에서 1.3L의 투석 완충액에 400 µM AAC C six prime, one eye 5 mL를 넣습니다. 이 작업은 저온실이나 냉장고에서 수행할 수 있으며, 8시간마다 신선한 완충액으로 교체하여 총 3회 투석합니다. 최종 투석 용액을 보관하십시오.

최종 투석액 750 milliliters를 0.45 micron 셀룰로오스 필터로 여과하여 4 °C에서 보관하십시오. 이제 러닝 버퍼(running buffer)라고 지칭하는 이 버퍼는 세척액 및 희석액으로 사용됩니다. 샘플의 경우, 0.2 micron 시린지 필터를 러닝 버퍼로 충분히 세척하십시오.

단백질 샘플을 도포하고 여과합니다. 단백질 용액을 보관하기 전, 원심분리관(conical tube)에 샘플을 조심스럽게 수집하고 표준 단백질 분석법으로 단백질 농도를 결정합니다. 본 실험에서는 280 nanometers에서의 흡광도(ABSORBENCE)로 단백질 농도를 측정하고 효소 농도를 계산합니다.

EXI 단백질체 서버에서 생성된 소멸 계수를 사용하여, 단백질을 장기 안정성을 최대화하는 방식으로 보관하십시오. AAC C six prime one eye는 동결 및 해동 후 활성이 유지되지 않으므로 4 °C에서 보관해야 합니다. 다음으로 리간드와 러닝 버퍼를 용해하십시오. 본 시연에서는 4 mg의 acetyl coenzyme A를 200 µL의 러닝 버퍼에 용해하여 25 mM 스톡 용액을 제조하였습니다.

이 리간드는 ITC 샘플을 준비할 준비가 될 때까지 -78 °C에서 보관할 수 있습니다. 먼저, AAC 6'1 I의 서면 프로토콜에 설명된 대로 C 값 64를 얻기 위한 효소 농도를 계산하십시오. 이는 192 µM의 농도에 해당합니다. 여과된 러닝 버퍼로 스톡 솔루션을 희석하여 이 농도의 거대분자 용액 2 mL를 준비하십시오. acetal co-enzyme a를 얼음물 배스에서 해동하십시오. acetal co-enzyme a 용액이 해동되면 부드럽게 혼합하십시오. 거대분자 농도에 결합 부위 수를 곱한 후 다시 10을 곱하여 리간드 용액의 농도를 계산하십시오.

25 millimolar ACE co-enzyme A stock solution 80 microliters를 running buffer 420 microliters에 첨가하고 혼합하여 acetyl co-enzyme A 용액을 준비합니다. 희석된 acetyl co-enzyme ACE 용액을 피펫 충전 튜브로 옮기고, 남은 25 Millimolar stock solution은 보관을 위해 minus 78 degrees Celsius로 되돌립니다. 희망하는 실험 작동 온도보다 1 degree Celsius 낮은 19 degrees Celsius에서 진공 상태로 a C six prime one eye 및 acetyl co-enzyme A 용액의 가스를 5분 동안 제거합니다.

주입용 시린지를 설치하려면, 미리 장착된 시린지 클램프가 홀더와 같은 높이가 될 때까지 시린지 홀더를 통해 시린지를 삽입하십시오. 두 번째 시린지 클램프를 주입용 시린지에 끼워 시린지 홀더 바닥에 단단히 밀착될 때까지 밀어 넣으십시오. 제공된 0.05 inch 볼포인트 육각 드라이브를 사용하여 클램프를 조심스럽게 조이십시오.

다음으로, 시린지 홀더를 피펫 홀더에 장착합니다. 피펫 인젝터를 주입용 시린지 안으로 조심스럽게 밀어 넣어 플런저 팁이 시린지의 구멍에 직접 맞물리도록 합니다. 완전히 삽입되면 시린지 홀더의 잠금 칼라를 피펫 인젝터에 돌려 고정합니다.

A a C six prime one eye 단백질 시료 용액을 로딩하기 전, 기기에 제공된 셀 세척 시스템을 사용하여 시료 셀을 최소 50 milliliters의 running buffer로 세척하십시오. 긴 바늘이 달린 2.5 milliliter 유리 주사기를 사용하여 시료 셀에서 잔류 버퍼를 흡입하여 제거하십시오. 깨끗하고 건조한 두 번째 긴 바늘을 사용하여 탈기 진공 장치에서 용액을 제거하십시오.

2.5 milliliter 주사기. A a C six prime one eye 단백질 샘플을 최소 1.8 milliliters 이상 조심스럽게 주사기에 흡입합니다. 공기 방울이 생기지 않도록 주의하십시오.

주사기에 단백질 샘플을 채운 후, 바늘을 샘플 셀에 삽입하고 셀 바닥에 살짝 닿게 합니다. 바늘을 약 1mm 들어 올린 다음, 샘플 셀 상단 위로 여분의 액체가 보일 때까지 샘플을 셀 내로 천천히 주입합니다. 셀 내에 갇힌 기포를 제거하려면, 오버플로 부분에 용액이 남아 있는지 확인하면서 바늘을 약 1cm 들어 올린 후, 약 0.25 milliliters의 용액을 빠르게 흡입했다가 다시 주입합니다.

이제 니들을 오버플로우 측면을 따라 조심스럽게 위로 밀어 올립니다. 샘플 웰에서 니들이 턱에 닿게 됩니다. 이 턱이 전개액의 목표 높이를 나타내므로, 턱 위의 모든 액체를 뽑아냅니다.

주입용 시린지를 채우기 위해, 플라스틱 튜브 블로팅 시린지를 충전 포트에 부착하고 플런저 팁을 충전 포트 상단까지 내립니다. 이제 DGA 리간드 용액이 담긴 피펫 충전 튜브를 피펫 홀더 바닥에 배치합니다. 시린지 팁이 충전 튜브 바닥에 닿지 않는지 확인하고, 용액이 로딩 시린지의 튜브로 소량 유입될 때까지 시린지로 용액을 천천히 흡입합니다.

다음으로, 플런저 팁을 내려 충전구를 닫습니다. 이는 충전구 닫기 버튼을 클릭하여 수행합니다. 그런 다음 로딩 과정에서 유입되었을 수 있는 기포를 제거합니다.

퍼지 리필(purge refill) 버튼을 클릭하여 퍼지 및 리필을 수행합니다. 퍼지와 리필을 총 3회 반복합니다. 퍼지 리필 과정이 완료되면 피펫 홀더에서 충전 튜브를 제거하고 실험용 티슈로 시린지 팁을 부드럽게 닦아냅니다.

이제 피펫 어셈블리의 시린지를 샘플 내부로 내립니다. 바늘이 쉽게 휠 수 있으므로 주의하여 천천히 진행하십시오. 잠금 칼라(locking collar)의 바닥 부분을 눌러 시린지가 완전히 삽입되었는지 확인하십시오.

주사기가 고정되면, 원하는 작동 온도를 설정하고 예상되는 최대 주입 열흐름보다 약간 높은 기준 전력을 선택하십시오. 이 예시에서는 작동 온도와 기준 전력으로 각각 20 °C와 20 µcal/s를 사용합니다. 그런 다음 원하는 주입 부피와 지연 시간을 프로그래밍하십시오.

여기서는 총 28회의 주입이 수행되며, 첫 번째 주입량은 2 µL이고 62번째 딜레이를 가집니다. 이후의 주입량은 10 µL이며 332번째 딜레이를 가집니다. 여기서 제시된 실험은 추가적인 곡선 생성에 필요한 단일 농도의 데이터 세트를 구축하는 기초를 제공합니다. 고분자 및 리간드의 농도를 낮추어 이 과정을 반복하십시오.

농도 오차를 최소화하기 위해 모든 고분자 및 리간드 시료가 동일한 스톡 용액에서 유래했는지 확인하십시오. 여기에 3.86 millimolar 리간드 acetyl coenzyme A를 192 micromolar의 미세 분자 A A C six prime one에 적정하여 얻은 가공되지 않은 등온 적정 열량 측정 트레이스가 표시되어 있습니다.

두 부위 순차 결합 피팅(two site sequential fit)을 통해 결합 파라미터를 결정하기 위해 적분된 눈 값을 사용하였습니다. 이 그래프는 다양한 농도의 ACE Coenzyme A와 AAC C six Prime One Eye의 ITC로 생성된 등온 곡선을 나타냅니다. 빈 원으로 표시된 실험 데이터는 두 세트의 부위 독립 모델(two sets of sites independent model)과 두 부위 순차 모델(two site sequential model) 모두에 피팅되었습니다.

두 사이트 순차 모델(two site sequential model)에서 더 나은 일치도가 관찰됩니다. 사용된 단백질 농도는 함께 제공된 텍스트에 정의되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 농도 변화가 결과에 급격한 영향을 미칠 수 있으므로 희석을 매우 정확하게 하는 것이 중요합니다.