Murine 췌장 아일릿 격리

안녕하세요, Greg Zott입니다. 저는 UCSF 당뇨병 센터의 Bluestone 연구소 소속이며, 오늘은 마우스 췌도(islets)를 분리하는 과정을 보여드리겠습니다. 이 절차는 C3 H 공여 마우스의 췌장에 콜라게나아제(collagenase) 용액을 주입하는 것으로 시작하며, 이후 췌장을 적출하여 소화시킨 후, 피콜(fial) 구배를 통해 췌도를 정제하고, 최종적으로 당뇨병 NOD 수용체 마우스의 신장 캡슐에 이식하기 위해 이를 수작업으로 선별하는 과정으로 진행됩니다.

본 절차를 시작하기에 앞서, 수정된 Hanks 완충액으로 ATE 용액을 희석하였으며, 사용 중인 마우스 계통인 C3H에 맞게 농도를 조절하였습니다. 저희는 0.8 mg/mL 콜라게나제(collagenase) 용액에서 소화가 더 잘 된다는 것을 확인하였으며, 이를 총담관에 주입하여 췌장을 팽창시키는 데 사용할 것입니다. 오늘 절차를 수행할 사람은 당뇨병 센터의 Pavo Codre입니다. 그는 마우스를 절개하여 장을 노출시킨 후 총담관에 주입을 진행할 것입니다.

털을 가라앉히기 위해 마우스에 에탄올을 분무한 다음, 발가락 압착법(toe pinch)을 통해 마우스가 적절히 안락사되었는지 확인합니다. 이제 Pavo가 정중선 절개를 통해 마우스의 복부를 열어 장과 췌장을 노출시킵니다. 또한 마우스가 완전히 안락사되었는지 확인하기 위해 횡격막을 절개합니다.

시작하기 전에 몇 가지 중요한 구조물을 짚어보겠습니다. 위는 바로 여기에 위치하며, 췌장이 십이지장과 그 윗부분에 연결되어 있습니다. 이곳은 간이며, 담낭과 여기 보이는 총담관을 찾을 수 있습니다.

이제 Pavo는 소장을 분리하여 총담관이 소장으로 들어가는 지점을 찾을 것입니다. 소장이 노출되면 모스키토 클램프로 총담관의 양측을 집습니다. 우리는 이러한 방식이 총담관 윗부분에 클램프를 고정하려는 다른 그룹들의 방법보다 더 많은 콜라게네이트(collagenates)가 췌장으로 유입되도록 한다는 것을 확인했습니다.

우리는 이 방법이 효소가 췌장으로 진입하도록 하는 데 더 효과적인 기술임을 확인했습니다. 이는 부드러운 시술입니다. 장을 찢지 않도록 주의해야 합니다.

클램프가 총담관의 양쪽에 부드럽게 위치하도록 합니다. 이제 담낭을 찾고, 담낭이 노출되면 이를 가이드 삼아 총담관에 콜라게나아제(collagenase)를 주입하겠습니다. Powell은 3 mL의 콜라게나아제 용액이 담긴 5 cc 주사기와 30 gauge 바늘을 사용하고 있습니다.

총담관에 진입하면서 콜라게나아제 용액으로 해당 관을 확장시키고, 장 근처에 도달할 때까지 총담관을 따라 내려갑니다. 내려가는 동안 효소 용액이 췌장으로 주입됩니다. 이제 췌장이 콜라게나아제 용액으로 팽창되었으므로, Powell은 지혈鉗(hemostats)를 제거하고 췌장을 장에서 조심스럽게 분리하여 마우스로부터 적출할 것입니다.

그는 그것을 위에서 제거합니다. 그런 다음 비장을 손잡이처럼 사용하여 췌장을 들어 올리고, 총담관 부위를 천천히 절단하여 분리합니다. 이렇게 하여 췌장이 드러나면 비장을 제거하고, 장간막 조직을 제거합니다. 그 후 췌장을 멸균된 유리 바이알에 담긴 2 mM collagenase 용액에 넣고 다시 얼음에 둡니다.

유리 바이알에 넣은 분리된 췌장을 이제 37°C 항온수조에 약 17분 동안 넣어둡니다. 췌장이 떠오르지 않도록 50 mL 코니컬 랙에 고정시켰습니다. 수조에 넣음과 동시에 타이머를 시작하며 소화 과정이 시작됩니다.

소화 시간이 완료되면 바이알을 꺼내어 부드럽게 흔들어 분쇄합니다. 조직이 분해되기 시작하면 바이알을 얼음 위에 놓습니다. 세척 버퍼가 들어 있는 400 mL 비커 위에 멸균 스크린을 배치합니다.

그 다음 췌장 소화물을 스크린 위로 세척 완충액 속으로 조심스럽게 붓습니다. 시연을 위해 후드를 끄고 후드 유리를 올렸으므로 작업 과정을 확인할 수 있습니다. 췌장 소화물을 비커에 부은 후, 바이알을 동일한 세척 완충액으로 헹구고 세척 완충액을 스크린 위에 붓습니다.

세척 완충액이 채워진 주사기를 준비합니다. 이를 사용하여 조직을 스크린을 통해 강하게 세척합니다. 이는 매트릭스에 부착되지 않은 느슨한 eyelet들을 제거하되, 막과 소화되지 않은 조직은 스크린에 남기기 위함입니다.

조직 세척이 완료되면, 일반적으로 절차 마지막에 이와 같은 상태가 됩니다. 튜브 바닥에 있는 췌장 조직을 이제 두 개의 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 세척합니다. 조직을 고르게 섞은 다음, 각 튜브의 펠렛 부피가 동일하도록 균등하게 나누어 줍니다. 이제 비커를 세척 버퍼로 다시 헹굽니다.

비커 벽면을 헹구어 내부에 남아 있는 모든 조직을 다시 회수합니다. 그런 다음 이를 두 개의 50 mL 원뿔형 튜브에 동일하게 나누어 담고, 세척 완충액을 채워 정량을 맞춥니다.

조직을 여러 번 뒤집어 섞어준 다음 원심분리기에 넣습니다. 이는 짧은 시간 동안 원심분리하는 과정입니다. 원심분리기가 1,000 RPM에 도달하면 작동을 멈춥니다.

이 시점에서 조직은 매우 민감하므로, 과하게 압착하지 않도록 주의해야 합니다. 튜브를 제거하고 세척 단계를 세 번 더 반복합니다. 이제 세 번째 세척이 완료되었습니다.

50 ml 원추형 튜브의 구성 성분을 15 ml 원추형 튜브로 옮기고 1,000 rpm으로 원심 분리한 후 정지시킵니다. 상층액을 제거하고 FI Call의 첫 번째 단계를 시작합니다. 현재 펠렛 형태의 췌장 소화물을 확보한 단계입니다.

조직이 펠릿에서 잘 떨어지도록 재현탁합니다. 첫 번째 밀도 구배 용액인 1 1 0 8을 추가합니다. 각 튜브에 5 mL씩 넣습니다.

그 다음 펠릿을 각 밀도 구배층에 넣고 충분히 섞어줍니다. 가장 밀도가 높은 구배층에서 조직이 고르게 분산되도록 하는 것이 중요합니다. 이제 1.096 밀도의 용액 2mL를 층층이 쌓아줍니다.

그 위에 1 0 6 9 밀도의 층을 2밀(mils) 두께로 쌓고, 다시 그 위에 1 0 3 7 밀도의 층을 쌓습니다. 밀도 층을 쌓는 동안 층이 섞이지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이제 모든 층이 튜브에 추가되었습니다.

여기 보시면 1108번, 91096번, 1069번, 그리고 1037번 튜브의 상단부입니다. 원심분리를 하지 않았음에도 조직이 이미 적정 밀도로 이동하기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 파이알 기울기 원심분리를 1800 RPM에서 15분 동안 가속하고, 튜브를 원심분리기에서 꺼낸 후에는 반드시 브레이크를 끈 상태로 유지하십시오.

0 0 9 6 층과 0 0 7 층 사이에 파블로의 췌도 조직 밴드가 잘 형성된 것을 볼 수 있습니다. 이제 처리 과정 중에 방출되었을 수 있는 조직 파편과 DNA를 제거하기 위해 0 3 7 층을 제거합니다. 멸균 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 췌도 층을 제거하고, 이를 25 mL의 세척 완충액이 들어 있는 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

fol은 eyelet에 독성이 있으므로 이 단계를 빠르게 수행해야 합니다. 실제로 저희는 0 6 9 및 0 9 6 층 전체를 제거했습니다. Pavo가 플라스틱 pasture 피펫의 윗부분을 자르고 세척 버퍼로 헹굽니다.

이전과 동일한 방식으로 안구를 원심분리합니다. 1,000 RPM까지 회전시킨 후 정지하고 상층액을 흡입하여 제거합니다. 안구는 세척액으로 3회 세척합니다.

이제 아일렛(Islet) 분리 과정을 모두 마쳤습니다. 소화 단계부터 폴리머 농도 구배 원심분리, 세 번째 세척 완충액 세척 후의 정제된 아일렛 단계까지 진행하였습니다. 분리된 아일렛을 RPMI 배지에 재현탁하여 조직 배양 플레이트에 분주하였습니다. 이렇게 준비된 아일렛은 이제 인비트로(in vitro) 분석이나 아일렛 이식과 같은 인비보(in vivo) 준비 과정에 사용할 수 있습니다.