Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

본 실험 절차의 전반적인 목표는 공여체 배아의 외배엽을 닭 배아의 발달 중인 상악으로 이식하여 키메라 배아를 만드는 것입니다. 이는 먼저 이식용 공여체 외배엽을 제거한 후, 호스트 부위를 이식 가능하도록 준비함으로써 수행됩니다.

절차의 마지막 단계는 공여자 조직을 수용부 부위에 놓고 이식편을 위치에 고정하는 것입니다. 궁극적으로 공여자 외배엽만이 독점적으로 생착된 결과를 얻을 수 있으며, 분자 및 형태학적 분석을 통해 재코딩된 공여자 진피의 기능을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 형태 형성 과정 중 다양한 조직의 역할을 규명하는 것과 같이 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

본 실험 절차는 저희 연구실의 선임 연구원인 Dr. Diane이 시연하겠습니다. 절차를 시작하기 전, 배지를 준비하고 필요한 모든 용액이 준비되어 있으며 적절한 온도인지 확인하십시오. 그런 다음, 적절한 보안경을 착용한 상태에서 알코올 램프 불꽃 위로 마이크로 모세관을 가열하여 끝을 가늘게 뽑아내십시오.

프로판 토치 불꽃에 텅스텐 바늘을 고정하여 끝을 날카롭게 만들기 위해 유리 핀을 제작합니다. 달걀 끝에 테이프 조각을 붙여 껍질에서 공여 배아를 추출하기 시작합니다. 그 다음 해부용 바늘 끝을 사용하여 테이프 중앙에 작은 구멍을 냅니다.

10 mL 주사기와 18 gauge 피하 주사 바늘을 구멍에 삽입하여 달걀에서 알부민 1 mL를 제거합니다. 그다음 해부용 바늘을 사용하여 껍질 상단에 작은 구멍을 냅니다. 이 구멍을 덮도록 두 번째 테이프를 붙입니다.

두 쌍의 핀셋을 사용하여 알에 원형 구멍을 냅니다. 배아를 잡아 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 접시에 넣어 세척합니다. 배아의 머리를 제거한 후, 상온의 무혈청 DMEM이 들어 있는 조직 배양 접시에 넣습니다.

포셉으로 머리를 잡은 상태에서 배양 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 스프링 가위를 사용하여 상악과 하악을 머리의 나머지 부분으로부터 거시적으로 해부합니다. 그런 다음 날카로운 면도날이 장착된 블레이드 홀더를 사용하여 상악에서 전비돌기를 잘라냅니다.

피펫을 사용하여 전두 비돌기를 PBS에 녹인 충분한 양의 disp가 담긴 30 millimeter 페트리 접시에 옮기고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 배양 시간이 경과하면 조직이 손상되지 않도록 주의하며 dispa 용액을 흡입하여 제거합니다. 그 다음 1% BSA가 포함된 DMEM으로 조직을 완전히 덮습니다.

소화를 중단하려면 조직을 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 그 다음 해부 현미경 하에서 작업합니다. 끝이 뭉툭한 텅스텐 바늘을 사용하여 조직을 고정한 뒤, 끝이 날카로운 텅스텐 바늘을 사용해 작업합니다.

외배엽을 다른 조직으로부터 벗겨내어 분리합니다. 준비가 완료되면, 수용체가 이식 준비가 될 때까지 BSA가 포함된 DMEM 내에서 이식 조직을 얼음 위에 보관하십시오. 앞서 시연한 방법을 사용하여 달걀에 윈도우를 만듭니다.

두 쌍의 핀셋을 사용하여 배아가 포함된 알을 해부 현미경 아래에 놓습니다. IGN 막과 양막을 잡고 조심스럽게 찢어 구멍을 내어 호스트 배아를 노출시킵니다. 머리를 고정시킨 상태에서 한 쌍의 핀셋을 오른쪽 눈에 대고 압력을 가하여 머리를 회전시킵니다.

포셉과 바늘을 사용하여 이식편이 들어갈 공간을 만들기 위해 숙주의 진피를 제거합니다. 준비된 이식편이 들어 있는 페트리 접시에 neutral red 2 µL를 첨가합니다. 유리 피펫을 사용하여 이식편을 숙주로 옮깁니다.

제거된 외배엽을 대체할 위치에 이식편을 놓습니다. 이식 후 이식편을 고정하기 위해 이식된 조직의 각 모서리에 유리 핀을 삽입합니다. 테이프로 윈도우를 단단히 닫습니다.

분석에 필요한 발달 단계에 도달할 때까지 배아를 인큐베이터에 넣어 둡니다. 이 이미지는 메추라기 특이적 anti Q-C-P-N-A 항체로 염색한 메추라기 병아리 URA 조직을 보여줍니다. 이식된 조직은 두 화살표 사이에 위치합니다. 여기서는 마우스-병아리 키메라에서 유래한 중간 조직에 QCPN 염색의 증거가 나타나지 않습니다. 다시 한번, 이식된 조직은 두 화살표 사이에 위치합니다. C에서는 sign B two 반복 서열에 특이적인 프로브를 이용한 하이브리드화 결과가 나타납니다.

class one 유전자의 미러링 분석 결과, sign B two의 발현이 여기 이미지로 표시된 이식편을 포함하는 영역으로 제한됨이 밝혀졌으며, 이는 트리크롬 염색된 메추라기-닭 키메라 거울의 이미지입니다. 트리크롬 염색은 콜라겐과 뼈를 청색으로 나타냅니다. 화살표로 표시된 부분에서 상악 골격의 중복이 관찰됩니다. 이 이미지는 다시 트리크롬 염색을 거친 마우스-닭 키메라 거울을 보여줍니다.

상악골의 중복이 관찰됩니다. 이 이미지는 마우스-닭 키메라의 조직인 닭 배아의 중배엽에서 정상적인 BMP seven 발현을 보여주는 방사성 탄소-12 하이브리다이제이션 결과입니다. 화살표로 표시된 바와 같이, 이식편에 인접한 중배엽에서 BMP seven 발현이 유도된 것을 확인할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 전두돌기(frontal process)와 비돌기(nasal process)의 발달을 조절하는 메커니즘을 평가하기 위해 닭 배아를 조작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.