모스의 효율적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중재 변환 Physcomitrella patens
2011년 4월 19일
변환하는 간단하고 효율적인 방법 Physcomitrella pantens protoplasts이 설명되어 있습니다. 이 방법은을 위해 프로토콜에서 적응됩니다 Physocmitrella protonemal 원형질과 Arabidopsis mesophyll의 원형질 변환 1.
이 실험 절차의 전반적인 목표는 SCO Metre 원형질체를 형질전환하는 것입니다. 이는 먼저 Drizly를 사용하여 식물을 소화시켜 수행합니다. 다음으로, 원형질체를 mannitol로 세척하여 drizly를 제거한 후, DNA 및 peg와 함께 배양합니다.
마지막으로, 형질전환된 원형질체를 플레이트에 도포하고 배양합니다. 최종적으로, 형광 현미경을 통해 형광 표지 단백질을 발현하는 형질전환 원형질체를 확인함으로써 결과를 얻을 수 있습니다. 본 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 박사후연구원인 Y lu가 담당하겠습니다.
이 기술의 주요 장점은 효율적이며 관심 단백질을 발현하는 원형질체를 일관되게 생성한다는 점입니다. 이끼 원형질체를 분리하려면, 먼저 스패튤라를 사용하여 페트리 접시에 8% mannitol 9 mL를 넣습니다. PP NH 4 플레이트 2~3개에서 5~7일 된 이끼를 mannitol에 옮깁니다. 이에 대한 내용 및 추가 시약 레시피는 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 2% drizly 3 mL를 첨가하고 실온에서 부드럽게 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다.
혼합물을 100 micron 메시로 여과하여 녹색의 균질한 현탁액을 얻습니다. 그 다음 여과액을 250 G에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 매우 조심스럽게 제거합니다.
원형질체를 500 µL의 8% mannitol에 재현탁합니다. 그다음 8% mannitol 9.5 mL를 추가로 넣습니다. 원형질체가 완전히 현탁되었는지 확인하십시오.
용액을 250 G에서 5분 동안 다시 원심분리하여 세척 단계를 두 번 더 수행합니다. 상청액을 제거하고 원형질체를 다시 현탁합니다. 먼저 500 µL의 용액에 현탁합니다.
그런 다음 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 8% mannitol 9.5 milliliters를 첨가합니다. 분리된 원형질체에 DNA를 형질전환하기 위해 현탁액 10 microliters 내의 원형질체 수를 측정합니다. 먼저, 원형질체 혼합물을 250 G에서 5분 동안 원심분리합니다.
상층액을 제거하고 원형질체(protoplasts)를 MMG 용액에서 mL당 1.6 million으로 재현탁합니다. 현탁액을 상온에서 20분 동안 배양합니다. 그다음, 60 µg의 DNA가 들어 있는 배양 튜브에 원형질체 용액 600 µL를 첨가합니다. 흔들어 섞어줍니다.
PEG 칼슘 용액 700 µL를 조심스럽게 첨가하고 흔들어 섞습니다. 이 대기 시간 동안 샘플을 실온에서 30분 동안 충분히 배양합니다. PRMB 플레이트를 셀로판으로 덮습니다.
그런 다음 현탁액을 3 mL의 W5 용액으로 희석하고 250 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. PEG를 제거하기 위해 원형질체(protoplast)를 2 mL의 PRMT 용액에 재현탁하고, 셀로판으로 덮인 PRMB 플레이트당 1 mL씩 분주합니다. 플레이트를 배양기 내 25 °C에서 보관합니다.
마지막으로, 형질전환 4일 후에 셀로판을 새로운 선택 배지로 옮깁니다. 이 그림은 하이그로마이신 저항성 카세트를 운반하는 15 µg의 super coiled plasmid DNA로 형질전환되어 원형질체로부터 재생된 18일 된 식물의 예시를 보여줍니다. 여기서는 동일한 super coiled plasmid DNA 30 µg을 원형질체에 형질전환하였습니다.
이 샘플에는 60 micrograms의 plaid DNA가 형질전환되었습니다. 마지막으로, 이 식물들은 hygromycin 저항성 카세트를 포함하는 동일한 super coiled plasma DNA 120 micrograms로 형질전환된 원형질체로부터 재생되었습니다. 형질전환 효율은 최대 60 micrograms의 DNA 농도까지는 영향을 받지 않습니다.
하지만 DNA 농도가 너무 높으면 이 과정에 방해가 됩니다. 데이터에 따르면 이 방법은 한 학기 동안 광범위한 DNA 양에 대해 일관된 결과를 제공합니다. 적절하게 수행한다면 이 기술은 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.
이 절차 이후에 일시적 RNAi 및 유전자 녹아웃과 같은 추가적인 방법을 수행하여 유전자 기능에 관한 추가적인 의문점을 해결할 수 있습니다.
개요
본 논문은 Physcomitrella patens의 원형질체를 형질전환하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 기술은 기존의 원형질체 형질전환 프로토콜을 응용한 것으로, 일관되게 성공적인 결과를 도출하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 식물생물학
- 유전공학
- 세포생물학
배경
- 원형질체는 세포벽이 제거된 식물 세포입니다.
- 형질전환 기술은 식물의 유전자 기능을 연구하는 데 필수적입니다.
- Physcomitrella patens는 식물 연구의 모델 생물로 활용됩니다.
- 기존의 원형질체 형질전환 방법은 복잡하고 시간이 많이 소요될 수 있습니다.
연구 목적
- Physcomitrella patens 원형질체의 형질전환을 위한 효율적인 프로토콜을 제공합니다.
- 원형질체 형질전환의 효율성과 신뢰성을 높입니다.
- 이끼의 추가적인 유전학 연구를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 원형질체를 분리하기 위해 Drizly로 이끼 조직을 소화합니다.
- 오염 물질을 제거하기 위해 만니톨로 원형질체를 세척합니다.
- PEG를 사용하여 분리된 원형질체에 DNA를 형질전환합니다.
- 형질전환된 원형질체를 선택 배지에서 배양합니다.
주요 결과
- 형질전환된 원형질체에서 형광 단백질이 성공적으로 발현되었습니다.
- 이 방법은 다양한 DNA 농도 전반에서 일관된 형질전환 효율을 보였습니다.
- DNA 농도가 높을수록 형질전환 성공에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
- 전체 과정은 약 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.
결론
- 이 방법은 Physcomitrella patens 원형질체를 형질전환시키기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.
- 이를 통해 일시적 RNAi 및 유전자 녹아웃과 같은 후속 실험이 가능해집니다.
- 이 프로토콜은 이끼의 유전자 기능을 이해하는 데 상당한 도움이 될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
PEG 매개 Physcomitrella patens 원형질체 형질전환은 효율적이고 재현 가능한 유전자 전달을 가능하게 하여, 식물 시스템에서의 고처리량 기능 유전체학 연구를 지원합니다. 이러한 역량은 유전자 기능을 조사하고, 타겟을 검증하며, 유전적 조작이 용이한 모델 내에서 경로 규명을 가속화하려는 초기 발굴 팀에게 매우 중요합니다. 이 방법의 확장성과 표준화 가능성은 포트폴리오 전반의 유전적 스크리닝 및 기전적 리스크 감소에 있어 가치가 높습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 이끼 세포로의 효율적인 DNA 전달을 통해 신속한 유전자 기능 조사가 가능합니다.
- 높은 빈도의 유전자 타겟팅을 지원하여 기능적 표적 검증 및 경로 분석이 가능합니다.
- 모델 시스템에서의 정밀한 유전자 변형을 통해 기전적 리스크 감소를 촉진합니다.
- 후속 생물학적 가설에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 스크리닝 분석을 위해 다수의 형질전환체를 생성하는 표준화된 프로토콜을 제공합니다.
- 재현 가능한 형질전환 효율을 구현하여 분석의 신뢰성과 확장성을 지원합니다.
- 화합물 평가 및 표현형 스크리닝을 위해 검증된 생물학적 시스템의 준비를 가능하게 합니다.
- 특수 장비에 대한 의존도를 낮추어 분석 개발 팀의 접근성을 높입니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 모델링과 관련된 일시적 RNAi 및 유전자 녹아웃 연구와 같은 하위 응용 분석이 가능합니다.
- 식물 기반 시스템에서 유전자 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 질환 관련 경로와 연계될 때 중개 바이오마커 탐색을 위한 플랫폼을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 형질전환 프로토콜은 초기 발견에서 리드 화합물 도출로 이어지는 연속 단계에 적합하며, 식물 모델에서의 유전자 조작, 타겟 검증 및 분석법 개발을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 효율적인 유전자 전달 및 발현 분석을 통해 가설 검증과 경로 규명을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 일관된 형질전환체 집단을 생성함으로써 분석 준비도와 재현성을 지원합니다.
- 분석: 비교 분석을 위해 형질전환 효율 및 단백질 발현과 같은 정량적 결과물을 제공합니다.
- 중개 연구: 전임상 모델 개발 및 바이오마커 식별에 정보를 제공하는 유전학적 연구를 가능하게 합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 유전학 연구에 폭넓게 적용 가능한 표준화된 형질전환 능력을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 유전자 기능 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 유전자 형질전환 워크플로우의 표준화, 재현성 및 확장성을 제공합니다.
- 전략적 가치: 강력한 초기 단계 데이터 생성을 가능하게 하여 go/no-go 의사결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 유전자 표적 및 경로의 리스크 조정 우선순위 선정과 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 원형질체 분리 및 형질전환을 위한 식물 세포 배양 및 무균 조작 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 결과 검증을 위한 원심분리 및 형광 현미경을 포함한 기본 실험실 인프라 이용이 가능해야 합니다.
- 프로젝트 간 재현성을 확보하기 위해 형질전환 파라미터의 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- Physcomitrella patens 외의 다른 식물 종 또는 모델 시스템에 적용하기 위한 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 형질전환 효율은 DNA 농도에 민감하며, 과도한 양의 DNA는 오히려 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
