랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

다음 실험의 전반적인 목표는 무작위 원뿔형 틸트(random conical tilt) 방법을 사용하여 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 얻는 것입니다. 이는 먼저 홀 카본 그리드(holy carbon grid) 위에 얇은 탄소 필름 층을 증착하여 단백질 복합체를 위한 지지 기판을 만들고, 두 번째 단계로 염색을 진행함으로써 달성됩니다. 시료와 염색액을 그리드에 도포하면 시료가 중금속 염에 둘러싸이게 됩니다.

그 후 전자 현미경 관찰을 통해 시료의 틸트 쌍 마이크로그래프(tilt pairs of micrographs)를 얻습니다. 마지막으로, 랜덤 원추형 틸트 방법(random conical tilt method)을 이용한 이미지 분석을 기반으로 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 보여주는 결과를 도출합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 랜덤 원추형 틸트 방법을 위한 시료의 적절한 준비와 이후 이어지는 이미지 처리 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.

시료 평가에 대한 예시 없이는 등급 판정 및 시료 준비 단계를 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시연이 매우 중요합니다. 랜덤 원추형 기울기법(random conical tilt method)의 원리는 전자 현미경 내에서 시료의 동일한 영역에 대해 한 쌍의 마이크로그래프를 촬영하는 것입니다. 하나는 시료를 기울이지 않은 상태에서 촬영하고, 다른 하나는 50에서 70도 사이의 각도로 기울인 상태에서 촬영합니다. 컴퓨터를 사용하여 디지털화된 마이크로그래프 쌍을 나란히 배치하고, 이 시연에서는 동일한 입자들의 이미지를 선택합니다.

이 이미지들은 3차원 좌표의 숫자로 표시되어 있습니다. 기울이지 않은 입자의 이미지와 기울인 파트너 입자의 이미지는 기울기 축의 방향과 기울기 각도에 의해 서로 연관됩니다. 기울이지 않은 입자 이미지들을 정렬하면, 방위각 공간을 채우는 다수의 기울인 입자 이미지들을 사용하여 기울인 입자 이미지들을 해당 asMule 위치로 가져올 수 있으며, 역투영 알고리즘을 통해 분자의 3차원 구조를 재구성할 수 있습니다. 그리드를 제작하려면, 먼저 100 mL 유리 비커에 0.45 g의 폴리비닐포말 수지와 90 mL의 클로로포름을 첨가하여 0.5% form VAR 용액을 준비하십시오.

흄 후드 내에서 비커를 알루미늄 호일로 덮고 form var 수지를 용해합니다. 작은 스터 바와 마그네틱 교반기를 사용하면 수지가 용해되는 데 약 15분이 소요됩니다. 그동안 미리 세척된 현미경 유리 슬라이드를 메탄올과 Kim wipes로 세척합니다.

폼바(form var) 수지가 클로로포름에 완전히 용해된 후, 용액 표면에 50% 글리세롤 1mL를 첨가합니다. 첨가하는 글리세롤의 부피를 조절하면 홀리 카본(holy carbon)의 기공 밀도에 영향을 줍니다.

초음파 처리기의 팁을 용액에 담급니다. 약 1인치 깊이에서 최대 출력으로 1분 동안 초음파 처리하여, 용액 형태의 글리세롤 액적 에멀젼을 만듭니다. 초음파 처리 시간이 길어질수록 홀리 카본(holy carbon)의 구멍 크기는 더 작아집니다.

이 단계 이후 용액이 우윳빛으로 변합니다. 초음파 세척 직후, 깨끗한 유리 슬라이드를 에멀젼에 수직으로 담급니다. 1초 후에 슬라이드를 꺼내어 필터 페이퍼로 슬라이드 바닥을 닦아내어 슬라이드 표면에 얇은 플라스틱 막이 형성되도록 합니다.

클로로포름이 증발한 후, 광학 현미경으로 필름의 구멍 밀도와 크기를 확인합니다. 여기에 설명된 준비 조건으로는 400 mesh 그리드의 각 사각형당 10~20개의 구멍이 생성되어야 하며, 구멍의 직경은 3~4 µm 사이여야 합니다. 유리 슬라이드가 마르면, 슬라이드 표면의 플라스틱 필름 가장자리를 자릅니다.

슬라이드를 물에 수직으로 담가 증류수 표면 위로 필름을 띄웁니다. 수면 위의 얇은 필름은 빛의 반사에 대해 얕은 각도로 관찰할 수 있습니다. 400 mesh 구리 그리드의 매끄러운 면이 아래로 향하게 하여 필름 위에 하나씩 올립니다.

종이 조각을 사용하여 격자가 있는 플라스틱 필름을 들어 올립니다. 종이를 뒤집어 건조시킵니다. 페트리 접시에서 종이를 메탄올에 담가 구멍 속에 남아 있는 글리세롤을 제거하고, 종이를 공기 중에서 건조시킵니다.

카본 증착기를 사용하여 그리드에 약 20 nanometers 두께의 카본 층을 코팅합니다. 이때 증착 시간을 조절하여 원하는 두께를 맞춥니다. 두께는 이미 두께를 알고 있는 카본 층의 회색조와 비교하여 결정할 수 있습니다.

폼바(form var)를 제거하기 위해 유리 페트리 접시에서 탄소 레이어 그리드를 클로로포름에 30분 동안 담근 후, 그리드를 건조시키면 수제 홀리 카본(holy carbon) 그리드가 완성됩니다. 다음으로, 갓 쪼갠 마이카 표면에 약 5 nm 두께의 얇은 탄소 층을 증착시킵니다. 그 후, 증류수 아래에 있는 여과지 위에 홀리 카본 그리드를 조심스럽게 올립니다.

자체 제작한 장치를 사용하여, 마이카 표면의 얇은 탄소를 수면 위로 띄운 후 이를 구멍 뚫린 탄소 그리드 위에 천천히 증착시킵니다. 그리드가 놓인 여과지를 집어 들어 건조시킵니다. 흄 후드 내에서 2% uranyl formate 용액을 새로 조제하여 엑소좀 복합체의 음성 염색을 시작합니다.

서면 절차에 설명된 대로, 빛 노출을 방지하기 위해 용액 튜브를 알루미늄 호일로 덮습니다. 용액은 동일한 날에 사용해야 합니다. 글로우 방전 장치를 사용하여 탄소 그리드 전체에 얇은 탄소층을 입히는 글로우 방전 처리를 수행합니다. 다음으로, 벤치 위에 깨끗한 파라필름 조각을 놓습니다. 파라필름 위에 포름산 염색 용액 50 µL 방울 세 개를 분주합니다. 희석 버퍼를 사용하여 엑소좀 복합체를 약 50 nM 농도로 희석합니다. 희석된 단백질 4 µL를 글로우 방전 처리된 그리드 위에 분주합니다.

샘플을 그리드 위에 1분 동안 그대로 둔 다음, 핀셋을 사용하여 필터 페이퍼로 잔여 용액을 흡수시킵니다. 그리드를 즉시 첫 번째 염색액 방울 위로 뒤집어 약 10초 동안 여러 번 앞뒤로 움직여 그리드를 헹굽니다. 이 과정을 세 개의 염색액 방울 각각에 대해 반복하고, 마지막 헹굼 후 염색액이 그리드 위에 1분 더 머물도록 둡니다.

그런 다음 거름종이로 염색약을 닦아냅니다. 그리드 표면에 얇은 염색액 층이 유지되도록 하여 흄 후드 내에서 그리드를 건조시킵니다. 샘플 그리드를 샘플 홀더에 넣은 다음, 홀더를 FEI TE nine 12 전자현미경에 장착합니다.

저배율에서 샘플 그리드를 확인하여 염색 상태가 가장 좋은 구역을 찾습니다. 상태가 좋은 구역은 약 1~2 µm 크기의 구멍이 십여 개 있으며, 그 내부에 어둡게 염색된 영역이 관찰됩니다. FEI 사용자 인터페이스의 low dose 모드를 켜고, low dose 모드에서 탐색 초점과 노출 위치를 정렬합니다.

카메라 길이를 1.5 meter로 설정하고 탐색 모드를 분할 모드로 설정하십시오. 초점은 150 K 배율로 설정하고, 노출은 1초의 측정 노출 시간과 함께 50 K 배율로 설정하십시오. 일반적으로 탐색 및 노출 모드 모두에서 그리드 상에 식별 가능한 특징을 이용하여 정렬을 수행합니다.

탐색 모드에서 염색 상태가 양호한 홀을 찾아 위치를 저장하십시오. 해당 영역의 CCD 사진을 촬영하십시오. 시편을 55도로 기울인 후 다시 사진을 촬영하십시오.

두 사진을 비교하여 두 마이크로그래프에서 쌍을 이루는 구멍들을 식별하십시오. 스테이지를 다시 0도로 기울이십시오. 저선량 키트를 사용하여 검색 모드에서 식별된 각 구멍을 약 -0.7 µm의 디포커스 상태에서 고배율로 촬영하십시오.

모든 홀의 사진 촬영이 완료되면, 동일한 배율에서 스테이지를 55도로 기울입니다. 약 -1.2 µm의 디포커스(defocus) 상태에서 기울어진 시료의 마이크로그래프를 촬영하십시오. 자체 제작한 holy carbon grid의 불규칙한 패턴을 이용하여, 저배율 마이크로그래프의 패턴을 바탕으로 이에 대응하는 기울기 쌍 마이크로그래프를 식별하십시오.

상관 관계 분석을 돕기 위해, 입자가 균일하게 분포되어 있고 입자 주변에 헤일로(halo)가 없는 현미경 사진 기울기 쌍을 선택하십시오. 입자 주변에 뚜렷한 염색 헤일로가 있는 현미경 사진은 데이터 처리를 위해 폐기해야 합니다. 절차의 프로그램 설정부터 시작하십시오.

Eman 패키지의 process 2D를 사용하여 이미지 처리를 시연하겠습니다. 이미지 형식을 변경하려면 iMagic five 패키지를 사용하여 2D 정렬을 수행하고 spider 패키지를 사용하십시오. 3D 재구성 및 정밀화를 수행하려면 Gatan 디지털 이미지인 DM three 형식을 spider 이미지 형식으로 변환하십시오.

process 2D 명령을 사용하여 입자 쌍을 선택합니다. spider 프로그램 패키지에 포함된 웹 프로그램을 통해, 프로그램은 spider 스크립트를 사용하여 선택한 모든 입자를 박스 아웃하고 입자의 좌표를 자동으로 저장합니다. 해당 스크립트는 기울어진 입자 스택과 기울어지지 않은 입자 스택을 모두 저장합니다.

기울이지 않은(un-tilted) 입자들을 IMAG five 형식으로 변환하십시오. EM two EM 프로그램의 밴드 패스(band pass)를 사용하여, IMAG five의 InCorp prep 명령어로 기울이지 않은 입자들을 필터링 및 마스킹하고, center 명령어를 사용하여 밴드 패스 마스킹된 입자들을 중심 맞춤 하십시오. IMAG five에서 IMAG five 프로그램들을 자동 실행하는 배치 스크립트를 사용하여, 입자들을 균질한 클래스로 반복적으로 정렬 및 분류하십시오.

다음으로, IMAG five의 class 명령에서 MSA 이름을 사용하여 입자의 클래스 조회 표를 생성하고, header 명령을 사용하여 각 입자의 정렬에 대한 병진 및 회전 값의 플롯 파일을 생성하십시오. iMagic five에서 EM two EM 프로그램을 사용하여 정렬된 입자를 spider 형식으로 변환하십시오. 그런 다음 클래스 조회 표를 spider 문서 파일로 변경하십시오.

각 입자의 정렬에 대한 회전 및 이동 값 또한 spider 문서 파일로 변환합니다. IMAG five에서 기울어지지 않은 입자들에 대해 수행한 것과 동일하게, 기울어진 입자들에 대해서도 밴드 패스 필터링, 마스킹 및 중심 맞추기를 수행하여 중심이 잡힌 기울어진 입자들을 위한 새로운 데이터 세트를 생성합니다. IMAG five에서 생성된 다중 참조 정렬 문서와 웹 프로그램에서 생성된 DCB 파일을 사용하여 각도 문서 파일을 생성합니다. spider의 역투영(back projection) 스크립트를 사용하여 각 클래스 평균에 대한 초기 모델 하나를 얻습니다.

마지막으로, RCT를 사용하여 최종 볼륨을 얻기 위해 spider 스크립트를 이용해 기울이지 않은 모든 입자를 대상으로 초기 볼륨의 투영 정밀화(projection refinement)를 수행합니다. 엑소좀의 재구성 결과가 약 50개 얻어졌습니다. 이 볼륨들은 기울이지 않은 입자의 50개 클래스 각각에 해당하는 기울여진 입자들로부터 생성되었습니다.

spider 패키지에 구현된 역투영(back projection)을 사용하여 투영 정합 정밀화(projection matching refinement)를 수행하였습니다. 이 볼륨들을 초기 모델로 사용하여 약 18 Å 해상도로 엑소좀의 3D 볼륨을 생성했으며, 이후 3D 맵에 복합체의 각 부분에 해당하는 원자 모델을 배치할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후면, 시료의 적절한 내러티브 스탠딩 그리드 생성부터 개별 마이크로그래프 획득, 그리고 최종적으로 이미지 분석 기술을 이용한 재구성 결과물을 얻기까지, RCT를 사용하여 3차원 재구성을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 여기서 설명한 프로토콜 외에도, 이미지 분석을 통해 최종 재구성 결과를 얻는 몇 가지 방법이 더 있습니다.

신뢰할 수 있고 정확한 재구성을 얻기 위해 가장 중요한 단계는 잘 준비된 표본을 사용하는 것입니다.