초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

본 절차의 목적은 집속 이온 빔(focused ion beam)과 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 뇌 조직의 특정 영역에서 연속 이미지를 수집하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뇌를 슬라이스로 절단한 후 염색하고 레진에 매립합니다. 두 번째 단계로는 매립된 뇌 절편에서 관심 영역을 절단하여 빈 레진 블록에 장착하는 과정을 수행합니다.

세 번째 단계는 울트라 마이크로톰(ultra microtome)으로 레진 블록을 다듬고, 현미경의 이온 빔을 사용하여 이미징할 영역만 분리하는 것입니다. 마지막 단계는 이온 빔을 사용하여 이미지를 촬영하기 전 얇은 층을 반복적으로 제거함으로써 레진 블록의 단면을 연속적으로 이미징하는 것입니다. 최종적으로, 관심 영역을 통과하는 연속 이미지를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이미지 시리즈는 자동으로 수집되며, 데이터셋은 일반적으로 등방성 복셀(isotropic voxels)을 가지므로 스택 내의 이미지 구조를 어느 각도에서나 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 직렬 절편 투과 전자 현미경(serial section transmission electron microscopy)과 같은 기존 방법보다 훨씬 더 높은 Z 해상도를 달성할 수 있다는 점입니다. 또한, 전자 토모그래피(electron tomography)와 비교했을 때, 수지 임베딩 샘플에 대해 최적의 해상도로 훨씬 더 넓은 부피를 이미징할 수 있습니다.

절차는 마취 후 관류시킨 쥐의 고정된 뇌를 적출하는 것으로 시작합니다. 뇌를 플라스틱 몰드에 담긴 따뜻한 5% aeros에 매립하고, aeros가 굳기 전에 뇌를 올바른 각도로 조정합니다. 뇌가 포함된 aeros 블록을 진동 절편기(vibrato slice)의 샘플 홀더에 장착합니다. 80 micron 두께의 관상면 절편(coronal sections)을 생성하며, 관심 영역이 포함될 수 있도록 필요한 만큼 충분한 수의 절편을 절단합니다.

다음으로 시료를 20 milliliter 유리 절연 바이알에 넣습니다. 바이알당 최대 10개의 섹션을 넣으십시오. 0.1 molar K coate 완충액으로 시료를 5분씩 3회 헹굽니다.

그런 다음 0.1 M K cacodylate 완충액에 포함된 1.5% potassium cyanide와 1% osmium tetroxide로 샘플을 30분 동안 염색합니다. 이어서 0.1 M K cacodylate 완충액에 포함된 1% osmium tetroxide로 샘플을 30분 동안 추가 염색합니다. 그 후 이중 증류수로 3분 동안 한 번 헹궈낸 다음, 이중 증류수에 포함된 1% al acetate로 30분 동안 염색합니다.

다음으로, 절편을 2회 증류수로 5분 동안 헹군 후, 농도별 알코올 시리즈로 각 단계마다 2분씩 탈수시킵니다. 다음 단계는 알코올과 혼합된 Duran resin의 농도를 점차 높여 절편을 포매하는 것이며, 각 교체 단계 사이에 30분을 둡니다. 에탄올과 resin의 비율을 50:50으로 시작하여, 30:70, 10:90 순으로 진행하고, 마지막으로 절편을 100% resin에 30분 동안 둡니다.

그 다음 배지를 100% 신선한 duran resin으로 교체합니다. 롤러 믹서에서 1시간 동안 천천히 교반합니다. 포매 후에는 나무 칵테일 스틱을 사용하여, 미리 몰드 분리제가 코팅된 유리 현미경 슬라이드 위에 절편을 배치합니다.

슬라이드에 가능한 한 많은 섹션을 올리되, 슬라이드가 너무 붐비지 않도록 주의하십시오. 현미경 슬라이드 사이에 식별 라벨이 배치되었는지 확인하십시오. 슬라이드를 65 °C 오븐에 24시간 동안 보관하십시오.

다음 날, 오븐에서 샘플을 꺼냅니다. 면도날을 유리 현미경 슬라이드 사이에 조심스럽게 밀어 넣고, 손가락으로 레진 층을 잡은 상태에서 슬라이드 사이에서 샘플이 포함된 레진 층을 제거합니다. 흐르는 물에 샘플을 부드럽게 세척합니다.

몰드 분리제를 제거하기 위해, 저배율 대물렌즈와 투과 조명이 갖춰진 실체 현미경 아래에 시료를 놓습니다. 미세 바늘을 사용하여 관심 영역을 표시합니다. 면도날을 이용해 관심 영역 주변으로 3 mm × 3 mm 크기의 작은 정사각형으로 절단합니다.

아크릴 접착제를 사용하여 작은 레진 블록을 공백 레진 블록의 상단에 부착합니다. 다음으로, 울트라 마이크로톰의 홀더에 블록을 고정합니다. 부착된 실체 현미경을 통해 관찰하면서, 면도날을 사용하여 관심 영역 주변을 다듬어 재료가 작은 피라미드 형태로만 남을 때까지 깎아냅니다.

울트라 마이크로톰에 고정된 유리 나이프를 사용하여 블록의 상단 표면에 대해 각도를 주어 관심 영역에 가깝게 블록의 가장자리를 절단합니다. 블록 표면의 치수를 기준으로 관심 영역을 정확하게 위치시킬 수 있도록 블록을 추가로 다듬습니다. 울트라 마이크로톰에서 블록을 분리하여 투과광 현미경 아래에 놓습니다.

관심 영역을 촬영합니다. 보석용 톱을 사용하여 트리밍된 블록을 카본 페인트가 도포된 나머지 레진 스터브에서 절단하여 분리합니다. 분리된 SA 블록을 SEM 샘플 홀더에 부착하고, 이미징할 면이 가장 바깥쪽 가장단을 향하도록 배치합니다.

접착제가 건조되면, 준비물을 크레센트 및 진공 증착 시스템으로 옮겨 블록 표면에 20 nanometers 이상의 얇은 금 층을 코팅합니다. 이제 레진에 매립된 조직 블록을 집속 이온 빔 주사 전자 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다. 샘플을 홀더에 끼워 현미경에 넣고 저배율에서 이차 전자 이미징을 사용하여, 관심 영역과 이미징할 블록 면이 정면을 향하도록 블록의 방향을 조절하십시오.

작업자는 이미징할 면이 밀링 빔과 평행하도록 블록을 방향 설정합니다. 이렇게 하면 13에서 27 nano amps의 이온 빔 전류를 사용하여 전자 빔이 이 면에 대해 54도 각도로 정렬됩니다. 전압은 30 kilovolts로 설정합니다.

이미징할 영역의 전면에서 좁은 띠 모양의 레진을 제거합니다. 다음으로, 후방 산란 이미징 모드로 전환하여 관심 영역 위에 위치한 밀링된 면을 관찰합니다. 앞서 촬영한 광학 현미경 참조 이미지와 밀링된 면의 이미지를 사용하여, 현미경의 가스 분사 시스템을 통해 블록에서 밀링 및 이미징을 수행할 정확한 영역을 찾습니다.

700 picoamps의 전류를 사용하여 관심 영역 상단의 블록 표면에 약 1 micron 두께의 탄소 또는 금속 보호층을 증착합니다. 마지막으로, 최종 이미지를 촬영할 블록 영역을 밀링합니다. 표면에 밀링 아티팩트가 더 이상 보이지 않을 때까지 밀링 빔으로 이 이미지 면을 완전히 밀링하십시오.

표면의 연속 이미징을 위한 현미경 파라미터를 설정하십시오. 일반적인 파라미터는 전압 1.2~2 kV, 픽셀 크기 4~20 nm입니다. 표면을 밀링하고 이미지 한 장을 획득하는 데 걸리는 총 시간이 2분 미만이 되도록 픽셀 체류 시간(dwell time)은 약 10 µs로 설정해야 합니다.

현미경의 열적 변화가 안정될 수 있도록 최소 2시간 동안 그대로 둡니다. 이후 밀링 및 이미징 프로세스를 시작하여 관심 영역의 연속 이미지를 획득합니다. 이 그림은 랩 브레인(wrap brain) 영역 내의 초미세 구조를 보여주는 블록 표면의 역대조 후방 산란 이미지를 나타냅니다.

모든 막과 거대 분자 구조가 관찰됩니다. 이 그림은 5 nm 간격으로 수집된 총 1,600장의 이미지로 구성되어 있으며, 이를 통해 등방성 복셀을 가진 이미지 스택이 생성되었습니다. 이 스택은 동일한 해상도로 모든 평면에서 이미징이 가능합니다.

이 영상을 시청하신 후에는 focused ion beam scanning electron microscope를 이용한 연속 이미징을 위해 뇌 조직을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.