엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

본 실험 절차의 전반적인 목표는 백만 개의 세포로부터 얻은 전체 세포 뉴클레오솜 준비물 내에서 번역 후 변형의 상대적 수준을 정확하게 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 고품질의 균질한 포유류 세포 배양물을 준비합니다. 그 다음, Dounce 균질기와 원심 분리기를 이용한 기계적 파쇄를 통해 세포로부터 핵을 분리합니다.

다음 단계는 핵 내에 존재하는 염색질을 소화시키고 일련의 저장액 추출을 수행하여 온전한 뉴클레오솜을 얻는 것입니다. 마지막으로, 적절한 대조군을 이용한 ELISA 분석을 통해 뉴클레오솜을 조사하여 특정 번역 후 수식화를 식별합니다. 결과적으로 뉴클레오솜 샘플 내에 존재하는 특정 수식화의 상대적 수준을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.

웨스턴 블로팅 및 크로마틴 면역침강법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 다수의 뉴클레오솜 수정 상태에 대한 전반적인 양상을 쉽게 파악할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 웨스턴 블로팅보다 훨씬 민감하고 정확하며, 일반적인 분자생물학 실험 설비를 갖춘 대부분의 실험실에서 수행할 수 있습니다. 이 방법은 주요 분화 및 리프로그래밍 사건이 발생할 때 어떤 일이 일어나는지와 같이 줄기세포 및 후성유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

절차를 시작하려면, 먼저 15 cm 플레이트당 3 mL의 trypsin을 사용하여 세포를 trypsin 처리합니다. 얼음처럼 차가운 PBS butyrate 20 mL를 첨가합니다. 세포를 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 1000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 수집한 후, 상층액을 흡입 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS butyrate 10 mL를 첨가하여 세척합니다. 세포 현탁액을 1000 RPM에서 5분 동안 다시 원심 분리합니다.

상층액을 제거하고 서면 프로토콜에 기술된 대로 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 용해 버퍼 4 mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 얼음 위에서 A type B pestle down homogenizer로 파이펫팅하여 20회 스트로크로 균질화합니다. 그 후, 균질물을 얼음 위에 놓인 원심분리 튜브로 옮깁니다.

샘플을 4°C에서 2000 G로 10분 동안 원심분리하십시오. 세포질 물질이 포함된 상층액을 제거하고 재현탁하십시오.

프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 C 2 mL에 펠릿을 현탁시킨 후, 현탁액을 차가운 원심분리 튜브에 담긴 5 mL의 30% sucrose cushion 위에 부드럽게 층을 이뤄 쌓습니다. 핵을 분리하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하여 2,400 G에서 5분 동안 원심분리하면, 핵은 쿠션을 통과해 이동하고 세포 파편은 계면에 남게 됩니다. 원심분리 후 모든 액체를 조심스럽게 제거하고, 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 C 250 µL에 핵을 다시 현탁시킨 뒤, 핵을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

뉴클레오솜 분리를 시작하려면, 핵에 0.1 molar 염화칼슘 3 µL를 첨가하고 온도가 평형을 이룰 때까지 37 °C 가열 블록에 둡니다. 그다음 10 µL의 마이크로코컬 뉴클레아제 버퍼에 희석된 마이크로코컬 뉴클레아제 2 unit을 첨가하고 37 °C에서 12분 동안 배양합니다. 피펫 팁으로 자주 혼합해 줍니다.

배양 후, 0.5 M sodium EDTA pH 8 6 µL를 첨가하여 반응을 중단시키고 얼음에 놓아 냉각합니다. 다음으로 시료를 2000 ×g에서 4분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛을 재부유시킵니다. 0.2 mM sodium EDTA 300 µL에 시료를 넣고, 가끔 부드럽게 피펫팅하여 섞어주면서 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.

4 °C에서 3000 G로 4분간 원심분리한 후, 유리 뉴클레오솜이 포함된 상층액을 새 원심분리 튜브에 수집하여 얼음 위에 보관함으로써 뉴클레오솜의 추가적인 재결합을 방지합니다. 펠렛을 이전과 같이 300 µL의 0.2 mM sodium EDTA에 현탁시키고, 가끔씩 부드럽게 혼합하며 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 샘플을 원심 분리합니다. 다시, 결과물인 상층액을 얼음 위에 있는 마이크로 원심분리 튜브 내의 나머지 샘플과 혼합합니다. 뉴클레오솜 ELISA 분석을 시작하려면, 96-웰 ELISA 플레이트에 뉴클레오솜과 코팅 버퍼를 사용하여 첫 번째 웰의 50 µL당 0.1 µg부터 시작하는 5단계의 2배 연속 희석 시리즈를 로딩합니다. 모든 희석 시리즈는 3반복으로 로딩해야 합니다.

코팅 버퍼만 포함된 웰을 대조군으로 포함하는 것을 잊지 마십시오. 플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용하십시오. 플레이트 워셔를 사용하여 상온에서 웰당 200 µL의 0.5% Tween 20 PBS로 플레이트를 4회 세척하며, 총 세척 시간은 10분으로 합니다.

이제 웰당 100 µL의 블로킹 용액을 넣고 회전 혼합기(rotator)를 사용하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 플레이트를 뒤집어 싱크대 위에서 빠르게 흔들어 블로킹 버퍼를 제거합니다. 다음으로, PBS 내 0.05% Tween 20 및 5% PSA 용액에 희석한 1차 항체를 웰당 50 µL씩 넣고, 회전 혼합기를 사용하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

1차 항체 배양 후, 플레이트 세척기를 사용하여 이전과 동일하게 플레이트를 세척합니다. 세척 과정이 완료되면, 5% BS, A 및 0.5%20이 포함된 PBS에 희석된 horseradish peroxidase 접합 2차 항체를 웰당 50 microliters씩 첨가하고, 로테이터 위에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양 후, 이전과 동일하게 플레이트를 세척합니다.

플레이트 워셔를 사용하여 플레이트를 현상합니다. 각 웰에 50 µL의 TMB Eliza 기질을 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 실온에서 ELIZA 플레이트의 웰이 파란색으로 변하며, 그 강도는 각 웰에 존재하는 뉴클레오솜 수정의 양에 비례합니다.

이제 반응을 정지시킵니다. 웰당 50 µL의 2N 황산을 첨가하십시오. 색상이 갈색으로 변할 것입니다. 플레이트를 1500 RPM에서 2분 동안 원심분리하여 기포를 제거하십시오.

이제 플레이트를 컬러메트릭 플레이트 리더기로 정량 분석할 준비가 되었습니다. 마지막으로, 450 nanometers에서 플레이트를 판독하고 분석을 위해 결과를 내보내십시오. 이 기술을 숙달하고 적절히 개발하면, 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

이 기술은 줄기세포 연구 분야의 연구자들이 전체 에피프로테옴 수준에서 분화 및 리프로그래밍 사건에 대한 후성유전학적 반응을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.