신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

Newly John 박사의 연구실에 오신 것을 환영합니다. John 연구실은 생물학적 응용을 위한 미세유체 플랫폼 공학을 전문으로 합니다. 본 영상에서는 일차 뉴런의 구획화 및 배양을 위해 설계된 미세유체 장치의 제작 및 활용 방법을 시연하겠습니다.

뉴런 디바이스는 2005년 8월 Nature Methods에 처음 게재되었습니다. 도입 이후, 이 뉴런 디바이스는 전 세계의 공동 연구자들에 의해 널리 사용되어 왔습니다. 뉴런 디바이스는 포토리소그래피로 미리 제작된 디바이스의 SUA 패턴이 포함된 실리콘 웨이퍼 위에 캐스팅된 PDMS 조각으로 구성됩니다.

이 장치는 세 가지 주요 특징을 가지고 있습니다. 지름 8 mm인 4개의 저장조, 폭 1.5 mm, 길이 7 mm, 높이 100 µm인 2개의 주 채널, 그리고 두 주 채널을 연결하는 폭 10 µm, 높이 3 µm의 마이크로 홈입니다. 마이크로 홈의 길이는 150 µm에서 900 µm까지 다양할 수 있으나, 표준으로 선택되는 길이는 450 µm입니다. 주 채널과 마이크로 홈이 수직이 되도록 장치를 관찰하면, 홈의 왼쪽에 있는 저장조들이 주 채널을 통해 서로 연결되어 있으며, 오른쪽의 저장조들 또한 마찬가지로 연결되어 있음을 알 수 있습니다.

이 기능은 액체가 주 채널을 통해 흐를 수 있게 하여, 세포를 로딩하고 배지를 교체하는 것을 가능하게 하는 중요한 특성입니다. 뉴런 디바이스는 기존의 조직 배양 플랫폼에 비해 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 세포체(soma)와 축삭(axon)을 구획화할 수 있습니다. 뉴런 디바이스를 사용하면 순수한 축삭 분획을 얻는 것이 가능합니다.

마이크로 홈의 크기와 길이는 축삭이 다른 메인 채널을 통과할 수 있게 하면서 세포체가 교차하는 것은 방지합니다. 둘째, 장치의 설계와 정수압을 활용하여, 장치의 한쪽 리저버 부피를 다른 쪽보다 높게 유지하는 것만으로 장치의 세포 측 또는 축삭 측 중 어느 한 곳에만 별도의 처리를 가하는 것이 가능합니다. 셋째, 장치의 순수 축삭 분획을 진공 흡입으로 절단할 수 있어, 연구자가 축삭 재생을 연구하고 관찰할 수 있습니다.

연구원 Hina Lee가 마이크로유체 신경세포 장치 준비 과정을 시연하겠습니다. 포토리소그래피를 통해 SU-8로 패턴이 형성된 3 Å 실리콘 웨이퍼를 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로유체 몰드를 제작합니다. 이러한 SU-8 패턴 실리콘 웨이퍼를 마스터 몰드 또는 간단히 마스터라고도 합니다.

PDMS를 경화제와 10:1의 중량비로 혼합합니다. 예를 들어, PDMS 15g당 경화제 1.5g을 사용합니다. 그런 다음 PDMS를 잘 섞어 실리콘 웨이퍼 위에 붓습니다.

실리콘 웨이퍼는 10 centimeter 폴리스티렌 페트리 접시에 담겨 있습니다. MA를 약 4 millimeter 두께로 덮기 위해서는 약 12 grams에서 15 grams의 PDMS가 필요합니다. 그다음 PDMS가 도포된 마스터를 페트리 접시의 뚜껑을 연 상태로 진공 데시케이터에 넣고 진공을 가합니다.

이는 경화제 교반 과정에서 PDMS에 유입된 기포를 제거하기 위해 수행됩니다. 기포가 제거되는 데는 약 15분이 소요됩니다. 진공 데시케이터에서 15분이 지난 후, PDMS가 도포된 마스터를 데시케이터에서 꺼냅니다.

PDMS 마스터에 여전히 몇 개의 기포가 남아 있습니다. 0.45 micron 필터가 장착된 에어건을 사용하여 남아 있는 기포를 모두 제거합니다. 그 후 마스터를 80 °C 핫플레이트 위에 1시간 동안 올려두어 경화시킵니다.

진공 데시케이터를 사용할 수 없는 경우, 마스터를 실온에서 몇 시간 동안 방치할 수 있습니다. 공기 방울은 시간이 지나면 자연스럽게 사라집니다. 핫플레이트를 사용할 수 없는 경우, PDMS는 실온에서 24시간 후에 경화됩니다.

경화 과정 동안 마스터가 수평을 유지하는지 확인하는 것이 중요합니다. PDMS가 마스터 위에서 경화되면, 수술용 칼을 사용하여 클린 후드로 옮깁니다. 장치 주변의 테두리를 따라 원형으로 절개합니다.

칼날을 PDMS에 삽입하여 실리콘 웨이퍼와 접촉시키는 것이 중요하지만, 웨이퍼에 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의해야 합니다. 그렇지 않으면 마스터의 장치 주변을 따라 원형으로 절단 부위가 생기면서 균열이 발생할 수 있습니다. 3인치 실리콘 마스터 하나당 4개의 장치가 있습니다. PDMS를 마스터에서 조심스럽게 떼어냅니다.

먼저 절개된 부위에 수술용 칼을 삽입하면서 가볍게 비틀어 시작할 수 있습니다. 몰드 위의 PDMS 소자는 매우 얇습니다. 8mm 조직 생검 펀치를 사용하여 소자 윗면에 리저버(reservoir) 구멍을 뚫습니다.

펀처에 남은 잔해물을 로드로 밀어내어 제거합니다. 그다지 장치를 4등분하고 과도한 PDMS를 다듬어 장치가 Corning 커버 글라스(1번, 24 mm × 40 mm) 위에 깔끔하게 맞도록 합니다. 질소 가스를 사용하여 남은 잔해물을 불어내어 제거합니다.

잘 떨어지지 않는 이물질은 3M Scotch Brand 4 7 1 비닐 테이프를 사용하여 제거할 수 있습니다. 이제 세척된 장치는 플라즈마 본딩을 할 준비가 되었습니다. 뉴런 장치를 커버 슬립에 짧게 본딩하기 위해 herrick 플라즈마 세척기를 사용합니다.

장치와 커버 슬립을 트레이에 올린 후, 트레이를 플라스마 세척기에 넣고 진공 펌프를 사용하여 챔버 내부의 공기를 배출합니다. 이때 PDMS 장치는 반드시 위를 향하게 놓아야 한다는 점에 유의하십시오. 즉, 설계된 면이 위로 오게 하여 플라스마 가스에 노출되도록 합니다.

진공 압력이 300 millitorr에 도달하면 전기 코일에 전원을 켜고 강도를 'high'로 설정합니다. 챔버 내로 소량의 공기가 유입되어 플라즈마 발생을 돕도록 도어를 약간 엽니다. 장치와 커버 글라스를 2분 동안 플라즈마 처리합니다.

챔버 내부의 보라색을 확인하십시오. 그것이 실제 플라스마입니다. 전기 코일은 전자, 이온, 중성 원자 또는 분자로 구성된 부분적으로 이온화된 가스인 플라스마를 생성합니다.

플라스마는 유리와 장치 표면에 반응성 종을 생성하며, 이를 함께 배치하면 영구적인 결합이 형성됩니다. 또한 플라스마는 표면을 친수성으로 변화시켜 액체 첨가를 용이하게 합니다. 플라스마 세척기는 장치를 멸균하는 역할도 합니다.

2분 동안 플라스마 처리를 한 후, 진공 상태의 전원을 끄고 챔버 내부로 공기를 유입시킵니다. 플라스마 처리된 유리와 미세유체 장치의 표면을 클린 벤치 내에서 서로 접촉하도록 조립합니다. 그다음, 장치들을 멸균된 60 mm 디시에 넣습니다.

플라스마 처리된 유리와 장치의 표면은 강력하고 비가역적인 결합을 형성합니다. 플라스마 결합 후 10분 이내에 장치를 유리에 고정하고, 장치에 polyol lysine을 첨가합니다. 10분 후, 장치의 친수성이 감소하게 됩니다.

이로 인해 PLL이 장치 내부로 진입하기 어려워질 수 있습니다. PLL을 첨가한 후 장치 내에 기포가 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 존재하는 기포를 제거하는 간편한 방법은 100 µL의 액체가 채워진 P 200 피펫을 사용하는 것입니다.

이 경우, PLL 팁을 메인 채널의 입구에 직접 대고 P 200을 강하게 누릅니다. 이 과정은 여러 번 반복해야 할 수도 있지만, 결국 피펫의 압력으로 인해 기포가 배출됩니다. PLL이 포함된 장치는 37°C, 5%CO2 조건의 표준 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

PLL과 함께 24시간 동안 배양한 후, 장치를 오토클레이브 멸균 탈이온수로 빠르게 두 번 헹굽니다. 이 과정에서 메인 채널 내의 액체는 절대 완전히 제거하지 않으며, 리저버(reservoir)에서만 액체를 제거합니다. 메인 채널에서 액체를 제거하면 기포가 유입될 수 있습니다.

두 번 빠르게 헹군 후, 장치를 오토클레이브 멸균 탈이온수로 다시 채우고 인큐베이터에 최소 3시간 또는 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, 장치를 물과 함께 하룻밤 또는 최소 3시간 동안 배양한 후, 다시 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 탈이온수로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 일차 쥐 신경세포(primary rat neurons) 배양에 필요한 보충제인 B 27과 glutamate가 포함된 신경 기초 배지(neural basal media)를 장치에 첨가합니다.

그 후 장치들을 나중의 사용을 위해 인큐베이터에 다시 넣어 둡니다. 이제 장치들은 뉴런을 배치할 준비가 되었습니다. 본 영상에서는 뉴런 장치를 제작하는 데 사용되는 소프트 리소그래피 기술을 시연하였습니다.

이 장치들은 뉴런 및 기타 관심 세포 유형을 배양하는 데 사용할 수 있습니다. 이 장치의 주요 장점은 장치의 한쪽에서 뉴런 세포체를 배양하고, 다른 쪽에서는 순수하게 축삭 성분만을 분리하여 구획화할 수 있다는 점입니다. 다음 영상에서는 E 18 태아 쥐의 대뇌 피질 뉴런을 준비하는 방법과 세포를 장치에 로딩하는 방법을 보여드리겠습니다.

John Lab에서 준비한 내용은 여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사합니다.