단일 셀 Transcriptome 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 전사체 분석을 위해 단일 세포로부터 샘플을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 분리에 적합한 세포를 찾는 것으로 시작됩니다. 그다음 분리할 세포 옆에 마이크로 피펫을 위치시킵니다.

다음으로 세포가 마이크로 피펫 팁 안으로 끌려 들어올 때까지 시린지에 흡입력을 가합니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로 피펫의 팁을 컬렉션 튜브 안에서 부러뜨리고, 마이크로 피펫에 남은 내용물을 튜브 속으로 배출하는 것입니다. 최종적으로, 본 프로토콜에 기술된 arna 증폭법을 사용하여 증폭된 물질의 마이크로어레이 분석이나, PCR 또는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 응용 방법을 통해 세포 간 mRNA 집단의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 단일 세포 간의 통찰력과 차이점을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 수상돌기나 특정 종류의 수상돌기와 같은 세포 내 구획에도 적용할 수 있어 수상돌기 기능에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Jennifer Singh이 담당하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, 쥐의 배아 18일차 해마에서 추출한 일차 뉴런을 35 mm 디쉬 내의 12 mm 커버슬립에 도말하고 서면 프로토콜에 기술된 대로 배양하였습니다. 수확용 피펫을 준비하려면, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 오토클레이브 처리된 유리 피펫을 전기생리학에 적합한 직경으로 뽑아내어 사용하십시오.

제조사의 프리셋 프로그램을 사용하므로, 팁이 세포 수집 전에 절단되기 때문에 보어 크기는 중요하지 않습니다. 세포를 수확할 준비가 되었을 때 팁이 손상되지 않은 상태로 유지될 수 있도록, 마이크로 피펫 보관 용기와 같은 먼지가 없는 환경에 피펫을 조심스럽게 보관하십시오. 수확한 물질을 보관하기 위해 2 µL의 PBS를 추가하여 필요한 수의 1.7 mL 에핀도르프 튜브를 준비하십시오.

조직 배양 후드 내에서 인큐베이터로부터 커버슬립이 담긴 35 millimeter 디쉬 1개를 꺼냅니다. 이 디쉬에서 커버슬립 한 장을 빠르게 꺼내 HBSS가 들어 있는 새로운 35 millimeter 디쉬의 뚜껑 위로 옮깁니다. 조작하지 않는 커버슬립의 경우, 세포의 상태가 나빠질 수 있으므로 즉시 인큐베이터로 되돌려 놓는 것이 중요합니다.

장시간 방치할 경우 문제가 발생할 수 있습니다. 세포 수집을 위해서는 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 40 x 대물렌즈의 도립 광학 현미경이 필요합니다. 홀더에서 유연한 튜브가 연결된 피펫 홀더를 사용하며, 수집 중 피펫이 원치 않게 움직이는 것을 방지하기 위해 튜브를 안정적인 표면에 고정하십시오.

튜브 끝에 바늘을 삽입하여 루어락(lure lock) 연결 방식의 1 mL 주사기를 장착하고 사용자 간에 교체할 수 있도록 합니다. 한 손의 손가락 사이에 킴와이프(Kim wipe)를 팽팽하게 잡고, 마이크로 피펫의 팁을 종이 위에 대고 1~2회 매우 부드럽게 문질러 팁 끝을 제어된 방식으로 파손시켜 마이크로 피펫을 준비합니다. 개구부의 크기는 표적 세포 크기의 약 75~100%가 되어야 합니다.

마이크로 피펫을 마이크로 피펫 홀더에 고정하고, 마이크로 피펫 홀더를 마이크로 매니퓰레이터의 인서트에 부착합니다. 마지막으로, 40x 대물렌즈를 설정합니다. 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓고 수확하기에 적합한 세포 영역을 찾습니다.

일차 뉴런 배양의 경우, 세포가 주변 세포들로부터 비교적 격리되어 있어야 합니다. 주변 세포나 돌기가 함께 수집되는 것을 방지하려면, 수집할 세포를 시야의 중심에 배치하십시오. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 피펫을 디쉬 내의 용액 방향으로 전진시켜 광 경로로 진입시킵니다.

피펫 팁을 용액 속으로 내립니다. 접안렌즈를 통해 보았을 때, 피펫이 시야 내에 그림자로 나타나야 합니다. 이때부터 세포 평면보다 훨씬 위쪽에서 주사기를 통해 가볍게 바람을 불어넣어 양압을 가합니다.

피펫 팁이 시야 내에 들어올 때까지 위치를 조절하고, 조동나사를 사용하여 피펫 팁에 초점을 맞춥니다. 이때 피펫의 내경(bore size)이 너무 큰지 또는 너무 작은지 평가합니다. 내경이 적절하지 않은 경우, 수집 영역 내에서 피펫이 파손되는 것을 방지하기 위해 적절한 내경의 마이크로 피펫을 찾을 때까지 다른 피펫으로 교체하십시오.

마이크로 조작기를 사용하여 피펫 팁을 세포 쪽으로 이동시키기 전에, 조동나사(course focus)를 사용하여 초점면을 전진시키십시오. 세포가 가까워지면 미동나사(fine focus)를 사용하여 세포와 피펫 팁 모두에 초점이 맞을 때까지 조정하십시오. 대상 세포에 도달하기 전에 양압 가압을 중단하여 세포가 커버슬립에서 밀려나지 않도록 하십시오.

마이크로 조작기를 사용하여 피펫 팁이 수확할 세포체에 닿도록 위치시킵니다. 주사기를 사용하여 세포가 피펫 팁 안으로 들어갈 때까지 입으로 부드럽게 흡입합니다. 세포가 피펫으로 들어오지 않는 경우, 팁을 세포 쪽으로 부드럽게 더 가까이 이동시킨 후 커버슬립에서 떨어질 때까지 아래쪽으로 움직입니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 즉시 위로 들어 올려 용액 밖으로 이동시킵니다. 홀더에서 피펫을 제거합니다. 준비된 1.7 milliliter 에펜도르프 튜브를 한 손에 잡고, 튜브 바닥 쪽 측면에 피펫 팁을 살짝 부러뜨려 분리합니다.

부러진 팁의 중심이 튜브 내부에 위치하도록 하여 0.1 milliliter 표시선을 맞춘 다음, 1 milliliter 주사기가 연결된 바늘을 피펫의 상단 개구부에 삽입합니다. 플런저를 빠르게 눌러 피펫 안의 용액이 튜브 속으로 분사되게 합니다. 이때 팁이 튜브 벽면의 액체에 닿지 않도록 주의하십시오.

모세관 현상으로 인해 액체가 피펫 안으로 다시 빨려 들어가므로, 세포는 피펫의 맨 끝부분에 남게 되며 이는 세포를 적절히 배출하기에 충분합니다. 데스크톱 원심분리기를 사용하여 튜브의 내용물을 빠르게 원심 분리하고, 추가 처리나 PCR 또는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 응용 분야를 위해 드라이아이스에 얼리거나 얼음에 보관하십시오. 여기에 분리된 뉴런을 성공적으로 회수한 예시가 나와 있습니다.

먼저, 세포 밀도가 상대적으로 낮은 영역을 선택했습니다. 그런 다음 피펫 팁을 원하는 세포 쪽으로 이동시켰습니다. 여기에서는 세포를 수확한 후의 시야가 표시됩니다.

주변의 프로세스들은 커버슬립 위에 남아 있음에 유의하십시오. 반대로, 이 그림은 효과적인 수집에 부적절한 크기의 피펫 팁 이미지 두 장을 보여줍니다. 이 팁을 사용하면 수집이 불완전하게 이루어지며, 여기 보이는 다른 팁은 주변 환경까지 함께 수집되는 결과를 초래합니다.

수확 및 RNA 증폭 후에는 바이오분석기(bioanalyzer)를 사용하여 증폭된 RNA의 분포와 양을 확인하는 것이 권장됩니다. 단일 세포 물질로부터 증폭이 성공적으로 이루어지면 총량이 수 µg 수준으로 나타나며, 분포가 매끄럽고 넓게 형성됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절한 수행 시 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 수행하는 동안에는 반드시 RNA-free 기술을 사용하는 것이 중요합니다.