매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

다음 실험의 전반적인 목표는 GAL4 발현을 조직 특이적 lipase와 GAL80 전환 도구를 사용하여 정교화하는 것입니다. 이는 enhancer trap Philippe 형질전환 초파리 라인 집단을 생성하고, 각 라인에서 lipase의 CNS 발현 패턴을 결정함으로써 달성됩니다. GFP 리포터 면역화학법과 GFP 리포트를 사용하여 글리아(glia) 발현과 신경세포 발현을 구분함으로써, 관심 있는 ET flip 라인의 GAL4 발현을 GAL80 전환 도구가 포함된 자손 초파리의 발현과 교차시킬 수 있습니다.

클론 분석은 눈과 같은 조직에서 GAL4 발현의 정밀화를 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 엔핸서 트랩 기반 라인을 GAL80 전환 도구와 함께 사용하여 초파리 연구 커뮤니티에서 이미 사용 가능한 방대한 GAL4 라인 모음을 신속하게 활용할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 개념은 제브라피시와 같이 GAL4 UAS 시스템이 도입된 다른 모델 생물로 확장될 수 있습니다.

이 방법은 행동의 기저가 되는 신경 회로를 매핑하는 데 있어 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜은 광수용기 세포의 일부 집합에서 flip base의 사용법을 보여주지만, 이 교차 방법은 비신경 조직을 포함한 다른 조직의 분석에도 적용될 수 있습니다. 더 많은 enhancer trap lipase 라인이 특성화됨에 따라 더욱 유용해질 것입니다.

GAL4/UAS 시스템은 초파리 생물학자들이 널리 사용하는 중요한 기술입니다. 대부분의 GAL4 라인의 한 가지 주의점은 발현 범위가 너무 넓어 flp-out 방법을 이용한 뇌 행동 매핑에 사용하기 어렵다는 것입니다. ET-flip 트랜스젠을 사용하여 GAL4 발현 라인의 발현 범위를 부분적으로 제한하기 전에는 관심 있는 특정 영역에서 GAL4 발현을 미세하게 조정하는 것이 불가능합니다.

우선, CNS에서 flip a의 발현을 시각화하기 위해 후기 발달 단계의 유충과 성체에서 ET flip x two 트랜스진의 발현 패턴을 파악하는 것이 유용합니다. 관심 대상인 ET t flip X two 트랜스진을 가진 수컷과, 자손을 통해 et flip 발현을 확인할 수 있는 GFP 리포터를 가진 처녀 암컷을 교배시킵니다. 해부를 위해 방랑하는 3령 F1 유충을 수집합니다. 유충들을 깨끗한 S guard dish에 옮기고 붓으로 이물질을 제거한 후, 1x PBS로 dish를 한 번 헹굽니다.

이제 디쉬에 얼음처럼 차가운 1× PBS를 채워 유충을 마취시킨 후, 유충의 CNS에 접근하기 위해 핀셋으로 입 갈고리(mouth hook)를 잡습니다. 앞쪽으로 뻗어 나온 구형 큐티클 근처를 잡고 뒤로 벗겨냅니다. CNS는 다른 일부 구조물과 함께 입 갈고리에 부착된 상태로 유지됩니다.

이제 핀셋을 사용하여 CNS를 해부하면서 CNS 주변의 모든 불필요한 구조물들을 제거합니다. 제거한 구조물들은 PBS가 채워진 3구 Pyrex dish에 각각 옮겨 담습니다. 모든 CNS 해부가 완료되면, 얼음 위에서 200 µL의 4% PFA에 완전히 담가 고정합니다.

CNS가 떠오른다면 주변 조직이 완전히 제거되지 않은 것입니다. 이러한 경우, 핀셋을 사용하여 CNS를 고정액에 다시 담가 15분간 고정하고, ice cold PBS로 3회 세척한 후 ice cold PBT로 다시 3회 세척하십시오. 이제 조직을 이미지화하거나 항체로 라벨링할 수 있으며, 또는 추후 사용을 위해 4 °C의 PBT에 보관할 수 있습니다.

유충 제작에 사용된 동일한 교배군으로부터 해부 전 F1 성체를 수집합니다. 큐티클 표면의 왁스를 제거하기 위해 파리 5~10마리를 차갑게 식힌 95% ethanol에 30초 동안 담급니다. 에탄올을 제거하기 위해 성체를 ice cold 1x PBS로 3ครั้ง 세척하고, 세 번째 세척 후 성체 한 마리를 ice cold 1x PBS가 채워진 35 millimeter sil guard dish로 옮겨 해부를 준비합니다.

복부 쪽이 위로 향하게 놓고 복부 중앙에 미니언 핀(minion pin)을 꽂습니다. 핀셋을 사용하여 다리를 제거함으로써 해부를 시작합니다. 그런 다음 지지대에 머리를 고정하고, 눈 아래쪽에서 머리 꼭대기 방향으로 큐티클을 벗겨내어 머리 큐티클을 제거합니다.

날카로운 핀셋을 사용하여 조심스럽게 뇌 주변의 track 조직을 제거하십시오. track 조직은 강한 자가형광을 띠며 고정 과정 중 뇌를 떠오르게 하기 때문입니다. 뇌는 성체 CNS의 일부일 뿐입니다. 나머지 부분은 흉부의 복측 신경삭(ventral nervous cord, VNC)이며, 이 또한 함께 적출해야 합니다.

먼저, 뒷다리 기부를 고정하고 흉부 큐티클을 목 기부까지 조심스럽게 벗겨내어 제거합니다. 둘째, VNC를 노출시키기 위해 흉부 큐티클의 양쪽 절반을 부드럽게 벌립니다. 셋째, 두 번째 다리 기부를 고정하고 첫 번째 복부 마디 근처에서 복부를 당겨 흉부로부터 분리합니다.

넷째, 상완 부위를 고정한 후 VNC 주변의 조직을 조심스럽게 떼어내어 VNC를 세척합니다. 경추 결합 조직을 둘러싸고 있는 결합 조직 고리를 떼어내고, 뇌를 수집하면서 계속해서 과잉 조직을 제거합니다. 그리고 뇌와 VNC를 한 쌍씩 얼음 위에 보관된 냉각된 1× PBS가 채워진 9-well Pyrex 디쉬로 옮깁니다.

성체 조직을 고정하려면 4% PFA에 담가 얼음 위에서 15분 동안 둡니다. 이후 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척하고, 이어서 PBT로 3회 세척합니다. 이제 조직은 이미지 촬영이나 항체 표지를 통해 형질전환 유전자 발현을 정확하게 분석할 준비가 되었습니다.

참조 체계를 제공하기 위해 신경세포 또는 교세포 마커로 CNS를 라벨링하는 것이 유용합니다. 먼저 조직을 신경세포 또는 교세포 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 준비물을 PBT로 5회 세척한 후 형광 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양이 끝나면 항체의 광퇴색을 방지하기 위해 플레이트를 호일로 감싸십시오.

PBS로 시료를 세척하고, 슬라이드에 시료를 통째로 마운트합니다. 커버슬립에 의해 조직이 눌리는 것을 방지하기 위해 OSHA 플라스틱 링을 사용하십시오. 이제 형광 현미경 하에서 GFP 및 LL 발현 패턴을 조사할 수 있도록 신경계 준비가 완료되었습니다.

일반적으로 flip 발현 패턴의 재현성을 확인하기 위해 3~5개의 반복 시료를 검사합니다. flip, a 라인의 flip 발현 패턴은 다른 외래 유전자와 함께 사용하여 GAL 4 억제제인 GAL 80의 발현 방식을 변경하는 데 사용될 수 있습니다. GAL 80 억제제 발현을 변경하는 것은 변화를 유도하는 효과적인 방법입니다.

GAL4 발현에서 한 가지 방법은 transgene GAL80 발현을 통해 GAL4 발현을 제거하는 것이며, GAL80 발현은 그렇지 않으면 눈 전체에서 퇴행을 유도하는 GAL4를 불활성화합니다. 여기서는 ET flip 라인 hash 6 88 A를 사용하여 F1 자손의 광수용체 일부에서 GAL80 전환 도구의 효과를 평가하고, 눈의 표현형을 부모 계통의 눈 표현형과 비교합니다. 눈의 기형이나 탈색이 나타나면 flip 발현 패턴이 광수용체에 존재하며 GAL80 flipout이 성공했음을 확인하는 것입니다.

상호 보완적인 비중복 전략은 동일한 관심 flip 라인을 사용하여 GAL 80 발현을 flip-in 시키는 것입니다. 이 전략은 다른 방법과 매우 유사하지만, 이제 F1 자손에서 ID 색소 침착과 퇴행이 억제됩니다. flip X two에서 확인하십시오.

광수용체 발현. CNS 해부법을 숙달하면 적절히 수행했을 때 성체는 약 5분, 유충은 1분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 성체와 Libre C 및 Ss 모두에서 기관(trachea)과 주변 조직을 제거하기 위해 날카로운 핀셋을 사용하는 것이 중요합니다. 해부 시에는 고정제가 없는 접시를 사용해야 합니다. 현재 무작위 클론을 생성하기 위해 Heat shock flip 방식이 사용되고 있습니다.

반면, enhancer trap flip을 이용하면 재현 가능한 클론을 생성할 수 있어 형태학적 및 행동 분석이 더 용이해집니다. finger 방법의 또 다른 장점은 추가적인 anan trap flip 기반 라인 및 다른 gal 라인을 사용하여 GAL four 발현 패턴을 더욱 제한할 수 있다는 점입니다. tubulin stop GAL 80 구성의 단점은 LAG four 및 U-A-S-K-I-R와 같은 특정 GA four와 UAS 이펙터의 조합이 초파리를 사멸시키기 때문에 서로 호환되지 않는다는 것입니다.

이 문제는 UAS Shiri Ts와 같은 조건부 UAS 이펙터를 사용하여 쉽게 해결할 수 있으며, 이를 통해 예상대로 제한 온도에서 행동을 관찰할 수 있습니다. 모든 인핸서 트랩 리파아제 라인이 유용한 수준의 높은 리파아제를 발현하는 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고, 여기서 설명한 핑거 기법은 초파리 연구자들이 발달 회로 또는 행동에 대한 모자이크 분석을 정교화할 수 있는 새로운 접근법을 제공합니다.