룽 공학을위한 절차

본 실험 절차의 전반적인 목표는 형태학적 및 생리학적으로 실제 폐 조직과 유사한 배양 폐 조직을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 쥐로부터 심장과 폐를 적출합니다. 다음 단계로 폐동맥과 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 캐뉼라가 삽입된 폐를 탈세포화를 위한 바이오리액터에 연결합니다.

탈세포화 및 세척 후, 폐를 멸균 배양 바이오리액터로 옮겨 세포 파종을 준비합니다. 절차의 마지막 단계는 준비된 세포군을 폐의 원하는 구획에 파종하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 통해 탈세포화된 세포외 기질에 영역 특이적 폐 마커를 발현하는 세포들이 효율적으로 재정착되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

기존의 체외 폐 세포 배양 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포가 분화된 표현형을 장기간 유지한다는 것이며, 따라서 3차원 생물학적 유래 기질 내에서 수주 동안 연구할 수 있다는 점입니다. 탈세포화를 위해 폐를 혈관 캐뉼라를 통해 바이오리액터 캡에 연결하고, 캡을 탈세포화 장치에 연결합니다. 폐 상단의 유리병은 링 스탠드와 부착된 클램프로 고정합니다.

이 시점에서 세포 물질을 제거하여 세포외 기질 스캐폴드를 제작할 수 있으며, 여기에 다시 세포 물질을 채워 넣을 수 있습니다. 공학적으로 제작된 폐 조직의 파종 및 배양을 위한 바이오리액터의 조립 과정이 이 도식에 나타나 있습니다. 기관 캐뉼라의 루어 락 커넥터는 기관 리저버와 메인 챔버 사이의 호흡 루프에 연결됩니다.

호흡 루프에는 두 개의 일방향 밸브가 포함되어 있습니다. 이는 배지가 폐로 들어올 때와 나갈 때 서로 다른 경로를 따르도록 배치된 것입니다. 내피세포 시딩을 위해 관류 라인에 소형 저장조가 일시적으로 통합되었습니다.

맥동 펌프를 사용하여 저장소에서 폐의 혈관 구획으로 세포를 이송합니다. 혈관 관류는 롤러 펌프를 사용하여 제공됩니다. 배지는 연결된 캐뉼라를 통해 폐동맥으로 관류되어 폐 혈관계를 통해 흐른 뒤, 폐정맥을 거쳐 배지가 관류를 위해 흡입되는 메인 바이오리액터로 직접 배출됩니다.

폐 상피를 호흡 루프 내에 주입하여 배치합니다. 폐가 포함된 메인 챔버와 기관 저장소는 폐의 장기 배양에 사용됩니다. 폐를 적출하고 동맥과 기관에 캐뉼라를 정확하게 삽입했다면, 갓 적출한 폐는 공기가 새지 않고 유지되어야 합니다.

이는 액체에 잠긴 상태에서 공기를 주입하여 확인할 수 있습니다. 공기 누출을 나타내는 기포가 발생하지 않아야 합니다. 프로토콜을 시작하려면, 폐가 가득 찰 때까지 과팽창되지 않도록 주의하며 sodium nitroprusside가 포함된 PBS를 주입하고, 즉시 기관 캐뉼라를 캡으로 막아 폐가 팽창된 상태를 유지하도록 합니다.

다음으로, 15 mmHg의 압력으로 PBS와 SNP를 사용하여 폐를 최소 15분 동안 관류합니다. 그 후, 기관 캐뉼라에서 스토퍼를 제거하여 폐의 공기를 뺍니다. 필요한 경우 PBS와 SNP로 15분에서 30분 동안 관류를 계속합니다.

관류 압력이 10~15 mmHg로 유지되도록 PBS와 SNP를 보충합니다. 장기 탈세포화 과정을 시작하기 위해, 바이오리액터 캡을 탈세포화 장치에 연결합니다. 그다음 폐를 캡에 연결합니다.

Y자형 캐뉼라에 연결된 루어 락(lure lock) 커넥터를 사용하여, 폐동맥 캐뉼라는 관류 라인에 연결하고 기관 캐뉼라는 자유롭게 띄워 둡니다. 조직의 완전한 탈세포화를 보장하기 위해서는 시스템 내에 공기가 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 동맥 및 기관 캐뉼라에 있는 일방향 밸브는 튜브 내 역류를 가능하게 하여 튜브 속의 기포를 제거하는 데 도움을 줍니다.

따라서 시린지를 사용하여 공기 방울이 제거되도록 하여, 모든 라인에 공기가 없음을 확인하십시오. 탈세포화 용액으로 관류를 시작하십시오. 탈세포화 용액으로 관류하십시오.

500 milliliters의 용액이 폐를 통해 관류될 때까지 최적 압력은 15 millimeters of mercury 미만으로 유지합니다. 이는 일반적으로 2.5시간이 소요됩니다. 유속은 보통 초기에 매우 느리게 설정하며, 두 번째 시간 동안 약 one milliliter per minute 또는 그 이상으로 빠르게 증가시킵니다.

관류 과정 동안, 폐와 기관 캐뉼라를 지지할 수 있는 충분한 양의 액체가 남아 있도록 확인하면서 바이오리액터에서 사용된 탈세포화 용액을 주기적으로 제거합니다. 탈세포화 용액을 이용한 관류가 완료되면, 폐와 바이오리액터를 조직 배양 후드로 옮깁니다. 장기 세척을 시작하려면 탈세포화 용액이 들어 있는 500 milliliter 병을 제거하고, 최대 1 liter의 멸균 PBS가 들어 있는 멸균 병으로 교체합니다.

진공 흡입기나 주사기를 사용하여 라인 내에 공기가 없도록 확인한 후, 동일한 방식으로 10 to 15 mmHg의 압력으로 혈관계에 PBS를 관류합니다. 탈세포화 과정과 마찬가지로, 무균 조작법을 사용하여 바이오리액터에서 폐 PBS를 주기적으로 제거하고 PBS 저장 용기를 교체하거나 다시 채웁니다. 신선하고 멸균된 PBS를 사용하여 최소 2.5 L의 멸균 PBS가 폐로 관류될 때까지 세척을 계속합니다.

이 과정은 일반적으로 헹굼 단계가 완료된 시점부터 탈세포화 프로세스 시작 후 이틀 정도 소요됩니다. 폐를 새로운 멸균 바이오리액터 시스템으로 옮기는데, 이때 시스템에는 신선한 PBS에 10% FBS와 10% Pen strep이 첨가된 용액이 들어 있어야 하며, 전체 관류 루프와 모든 기도 라인이 액체로 가득 찼는지 확인하십시오. 이후부터는 맥동 펌프를 사용하여 5 mm/min의 속도로 폐를 관류합니다.

10% FBS와 10% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PBS로 하룻밤 동안 관류하여 폐 세포외 기질 스캐폴드를 멸균합니다. 이 단계를 마친 후, 폐를 37°C 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 또는 온도가 평형을 이룰 때까지 유지합니다. Ben Nase 처리를 준비하기 위해, 다음 단계로 폐에 Ben Nase를 처리합니다.

각 폐의 잔류 DNA를 제거하려면, 먼저 10 milliliter 주사기 하나에는 Prewarm Ben Nase buffer만 채우고, 다른 10 milliliter 주사기에는 Ben Nase buffer로 희석하여 90 units per milliliter 농도가 되도록 Ben Nase를 채웁니다. 폐의 관류를 중단하십시오.

그다음 폐로 공기가 주입되지 않도록 주의하며 Ben Nase 완충액으로 기도를 팽창시킵니다. 1분 동안 폐의 공기가 빠지도록 둡니다. 그런 다음 Ben Nase 용액으로 폐를 팽창시킵니다.

다시 한번, Ben Nase로 팽창시킨 후 폐에 공기가 들어가지 않도록 주의하십시오. 37 °C에서 관류나 환기 없이 폐를 1시간 동안 그대로 둡니다. 1시간이 지나면 바이오리액터에 이미 들어 있는 10% FBS 및 10% penicillin streptomycin이 첨가된 PBS로 관류를 재개하고, 다음 날까지 밤새 관류를 계속합니다.

세척 및 멸균 후, 긴 세포외 기질 스캐폴드를 세포 재군집화가 가능하도록 준비합니다. P-B-S-F-B-S benzo a 용액을 250 milliliters의 배양액으로 교체합니다. 세포를 주입하기 전 최소 1시간 동안 배양액을 관류시키고, 세포를 파종하기 직전에 신선한 배양액으로 교체합니다.

장기 재생을 위해 다양한 세포원을 활용할 수 있습니다. 본 과정에서는 상피세포 집단을 이용한 시딩(seeding) 방법을 시연합니다. 먼저, 원하는 상피세포 집단의 세포 현탁액 15 milliliters를 담은 주사기를 준비하십시오.

다음으로, 기도 저장조에 80 milliliters의 배양액을 채우고 모든 환기 라인에 공기가 없는지 확인합니다. 그런 다음 바이오리액터를 37 degrees Celsius 조직 배양 인큐베이터에 넣고 환기를 위한 시린지 펌프를 연결합니다. 15 milliliter의 세포 현탁액을 기관 캐뉼라에 주입하여 단일 신속 볼러스 방식으로 폐에 세포를 파종합니다.

메인 바이오리액터의 공기 필터가 캡으로 밀봉되었는지 확인하십시오. 그런 다음 즉시 시린지 펌프를 사용하여 분당 3 milliliters의 속도로 메인 바이오리액터에서 60 milliliters의 공기를 추출하는 단일 저속 호흡 과정을 시작하십시오. 이 과정은 약 20분 동안 지속됩니다.

그 후 폐를 약 18시간 동안 정적으로 유지합니다. 분당 약 0.5 milliliters의 속도로 천천히 혈관 관류를 시작하십시오. 장기 배양 중 관류는 일반적으로 분당 1에서 3 milliliters의 속도로 수행됩니다.

상피 세포 배양 중 롤러 펌프를 사용할 때, 환기는 일반적으로 분당 1회의 호흡 횟수와 5~10 mL의 일회 호흡량으로 지속적으로 제공됩니다. 시린지 펌프를 사용할 때는 공기를 주기적으로 흡입하고 바이오리액터 내부로 주입하여, 메인 챔버 내부를 음압과 대기압 상태로 교차시킴으로써 호흡을 유도합니다. 환기 중에는 바이오리액터의 기밀 상태를 유지해야 하므로, 매일 환기를 일시 중지하고 메인 챔버 내부의 공기를 교체해야 합니다.

또한, 배지는 약 3~4일마다 교체해야 합니다. 배양 과정 중 폐 상피와 혈관 내피를 배양함으로써 매회 전체 부피의 약 절반을 교체해야 합니다. 바이오리액터에 장착된 스캐폴드를 통해, 짧은 시간 동안 가스 교환이 가능한 폐 조직을 생성할 수 있습니다.

탈세포화된 쥐 폐의 H&E 염색 결과와 비교하기 위해, 여기에서는 천연 쥐 폐의 표준 hematoxylin 및 eosin 염색 결과를 보여줍니다. 최종 탈세포화된 세포외 기질은 세포 물질이 완전히 제거되어야 하며, 천연 폐의 육안적, 현미경적 및 초미세 구조적 특성을 유지해야 합니다. H&E 염색을 통해 불충분한 탈세포화 또는 세척으로 인해 스캐폴드에 남아 있는 DNA 잔해를 시각화하여, 세포 파종 및 이후의 폐 배양을 위한 최적의 조건을 확인할 수 있습니다.

또한 바이오리액터는 폐의 5개 엽 전체에 걸쳐 세포가 고르게 분포하게 해야 하며, 세포외 기질 스캐폴드의 약 70%를 덮어야 합니다. 이 이미지들은 면역형광 염색을 통해 천연 폐와 재세포화된 폐를 비교한 것입니다. 주요 폐 마커의 경우, 배양된 세포군은 Clara 세포 분비 단백질 pro secretory protein C와 Aquaporin five에 대해 양성 반응을 보입니다.

모든 패널에서 관심 마커는 빨간색으로, DAPI 염색된 핵은 파란색으로 표시되어 있습니다. 탈세포화부터 재세포화까지의 이 절차를 숙달하면, 적절히 수행했을 때 4~5일 내에 완료할 수 있습니다.