Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 배아줄기세포의 심근세포 분화에 필요한 핵심적인 시간적 조절 기전을 규명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 96-웰 라운드 바텀 플레이트에서 배아체(EB)를 형성하여 EB 형성 과정을 표준화하고, 두 번째 단계로 정해진 시간 경과에 따라 단백질 또는 화학적 조절제를 EB에 첨가함으로써 조사 대상 경로의 시간적 제어를 수행합니다.

다음으로, 다양한 신호 조절 체계의 유도 효율을 결정하기 위해 박동하는 EBS를 수동으로 정량화합니다. 박동하는 EBS의 형성 비율과 hanging drop법을 이용한 확인을 통해 심근세포 분화에 필수적인 신호 전달 경로의 시간적 요구 사항을 보여주는 결과를 얻습니다. hanging drop과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 노동 집약적인 절차를 표준화 및 단순화하여 정량화를 위한 직접적인 판독이 가능하다는 점입니다.

이 방법은 원하는 세포 유형으로의 분화를 유도하는 핵심 신호 전달 응고 체계를 식별하는 것과 같이 줄기세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)가 첨가된 마우스 ES 세포 배지를 사용하여 10cm 세포 배양 플레이트에서 마우스 배아줄기세포를 배양합니다. ES 세포의 합류도(confluence)가 50~70%에 도달하면 사용할 준비가 된 것입니다.

ES 배지를 제거하고 멸균된 PBS 5 mL로 세포를 한 번 헹굽니다. 각 플레이트에 0.05% trypsin EDTA 2 mL를 첨가하고, 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다. 다음으로, 플레이트당 ES 배지 3 mL를 넣어 trypsin EDTA 반응을 중단시킨 후, 세포를 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

분당 1000회 회전 속도로 3분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후 상층액을 제거하고 원하는 양의 EB 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 수를 측정하고 세포 농도가 5 × 10³ cells/mL가 되도록 희석합니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 라운드 바텀 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 세포가 포함된 EB 배지 100 µL를 분주합니다. 필요한 96웰 플레이트의 수는 실험 조건 및 시점의 수에 따라 달라집니다. 심장 형성의 주요 신호 전달 경로에 대한 결정적인 시간 범위를 확인하기 위해, 96웰 라운드 바텀 마이크로타이터 플레이트를 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 배양합니다.

특정 신호 전달 경로의 조절제를 ES 세포에 첨가합니다. 96-웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 배지로 희석한 신호 조절제를 다양한 시점에 첨가합니다. 각 96-웰 플레이트 웰의 절반은 각각의 처리 시작 시점에 사용됩니다.

각 시점마다 나머지 48개 웰에 차량 대조군(vehicle control)을 추가합니다. 서로 다른 정지 시점에서, 배지를 교체하여 각 웰의 신호 조절제(signaling modulators)를 세척하며, 이때 배아체(embryonic bodies)가 흐트러지지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 서로 다른 정지 시점에 맞춰, 웰의 EB 배지를 교체하여 조절제를 세척합니다. 96-웰 플레이트를 약 10도 각도로 기울이고 멀티채널 피펫을 사용하여 웰에서 배지를 조심스럽게 제거합니다.

그 후, 48시간 이상의 처리가 필요한 경우 각 웰에 조절제가 없는 EB 배지를 다시 추가합니다. 원하는 종료 시점까지 이틀마다 신선한 조절제가 보충된 EB 배지로 교체하십시오. ES 세포를 96웰 플레이트로 옮겨 EBS가 유도된 지 7일째 되는 시점에 현미경으로 EB 수축 상태를 관찰합니다.

각 처리 시간 경과별로 수축하는 EBS의 백분율을 구하기 위해, 수축하는 EBS가 있는 웰을 양성으로 판정합니다. 96-웰 플레이트 실험을 통해 확인된 심장 형성 신호 전달의 시간 창은 매달린 방울법(hanging droplet)으로 제작된 EBS에서 검증할 수 있으므로, 매달린 EB 방울을 제작합니다. 먼저, 나중에 방울이 변형되는 것을 방지하기 위해 페트리 접시에 3~4 mL의 PBS를 추가하여 준비합니다.

다음으로, 최종 밀도가 2.5 × 10⁴ cells/mL가 되도록 준비한 ES 세포 현탁액을 접근이 용이하도록 박테리아 배양 접시에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 페트리 접시의 뒤집힌 뚜껑 위에 ES 세포 20 µL 방울을 떨어뜨립니다. 이때 개별 방울들이 서로 닿지 않도록 주의하십시오.

일반적으로 덮개 하나당 최대 80방울까지 담을 수 있습니다. 그런 다음 덮개를 PBS가 들어 있는 페트리 접시 위로 다시 뒤집어 37 °C, 5% carbon dioxide 배양기에서 48시간 동안 배양하여 EB가 형성되도록 합니다. 48시간 후, 각 덮개의 매달린 방울에서 형성된 EBS를 3 mL의 EB 배지로 씻어 내립니다.

두 개의 EBS 뚜껑을 새 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시를 37 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 4일 동안 배양합니다. 4일째에 부유 상태의 EBS를 일반적으로 0.2% Gelatin이 코팅된 6-웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 30개의 EBS를 옮긴 후, 96-웰 플레이트 실험에서 확인된 기간 동안 신호 전달 조절제를 처리하여 배양합니다. 이는 현탁 방울(hanging droplets)을 만든 지 7일 후가 됩니다.

현미경 하에서 EBS를 관찰하여 EB 수축 여부를 확인합니다. 96-웰 플레이트의 라운드 바텀 웰에서 배양된 ES 세포는 4일 차에 형성된 EB의 대표 이미지와 같이 EBS를 형성합니다. ES 세포의 심근 분화에 있어 결정적인 시점은 차량 대조군과 비교했을 때 신호 조절제 처리에 의해 수축하는 EBS의 비율이 가장 높은 시간 창을 의미합니다. 여기에는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 분화 10일 차에 dorsal morphine 처리된 ES 세포로부터 형성된 자발적으로 수축하는 심근세포 초점이 나타나 있습니다.

이 영상을 시청한 후, ES 심장 발생 과정에서 주요 신호 전달 경로의 결정적인 시간적 조절 창을 효율적으로 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.