자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

본 실험은 지질 결합 단백질을 식별하고, 지질 소포의 정의된 막 환경에서 지질-단백질 상호작용을 분석하기 위해 설계되었습니다. 세포 균질액의 지질 결합 단백질을 갓 조제한 포스파티딜세린 및 세라마이드 지질 소포와 함께 배양합니다. 이후 반응 혼합물에 Xin V 접합 자성 비드를 첨가하여 지질 소포와 결합된 단백질을 자성 비드에 고정시킵니다. 다음으로, 자기 활성 세포 분리법(magnetic activated cell sorting)을 통해 단백질-지질 소포를 정제합니다.

지질 결합 단백질의 입증된 결과를 확인하려면, SDS page Western blotting을 사용하여 MDCK 세포에서 발현된 내인성 및 재조합 비정형 PKC와 특정 세라마이드 결합 도메인의 lyx 정제를 보여주십시오. ELISA 또는 표면 결합과 같은 표면 플라스몬 공명 분광법과 같은 기존 방법과 비교하여 이 새로운 기술의 주요 장점은 지질-단백질 상호작용이 막과 유사한 환경에서 이루어지며, 결합 단백질을 정제하고 분석할 수 있다는 점입니다. 이러한 질환에서는 생리적인 지질-단백질 상호작용이 손상되기 때문에, 이 기술의 활용 가능성은 지질 관련 질환의 치료 및 진단으로 확장됩니다.

이러한 질병 중 일부는 단백질 표적이 알려지지 않아 확인이 필요합니다. 지질 기반 치료제를 설계하려면, 먼저 100 µL의 sical 완충액 내에 등몰량의 phosphatidyl serine과 C 16 ceramide 혼합물을 건조시켜 준비한 지질 SLE로부터 시작하십시오. 0.1 mM manganese chloride가 첨가된 300 µL의 sical 완충액을 넣은 후 1시간 동안 초음파 처리하십시오. 시료를 4 °C에서 12,000 ×g로 20분 동안 원심 분리한 다음, 거대 지질 소포 펠릿을 100 µL의 sical 완충액에 재현탁하십시오. 1 nM의 vibrant cm DII 형광 염료를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 max 분리 후 SLE 분획의 시각화를 용이하게 하십시오. 원심 분리를 통해 vibrant cm dai로 염색된 phosphate, syrian ceramide SLE의 분홍색 펠릿을 회수하여 100 µL의 tris 완충액에 재현탁하십시오.

다음으로, 계면활성제가 없는 세포 용해물을 준비하기 위해 10 mM tris, hydrogen chloride, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제가 포함된 300 µL의 고장성 완충액에서 세포를 초음파 처리한 후 원심분리합니다. 막 파편을 제거하기 위해, 이제 투명한 세포 용해물을 지질 물리적 현탁액에 첨가하고 혼합물을 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 세포 용해물에는 phosphate aerin이 포함된 내인성 막이 포함되어 있을 수 있으므로, 추가 원심분리 단계를 통해 용해물에서 이러한 막을 제거하는 것이 권장됩니다.

반응 혼합물에 XNV 결합 버퍼 20 µL와 XNV가 접합된 자성 비드 용액 50 µL를 첨가하여 4 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 자기 활성 세포 분리(magnetic activated cell sorting)를 수행합니다. 다음으로, 항체 경쟁 분석에서 지질의 존재 여부와 양을 결정하기 위해 마이크로플레이트 형광 리더기를 사용하여 통과액(flow through)과 용출 분획(elution fractions) 내의 vibrant CM DII 형광을 모니터링합니다. A PKC와 세라마이드 포스포세린 소포의 결합 반응 특이성을 검증하기 위해, 1 µg의 anti P KC Zeta 토끼 다클론 항체를 세포 용해물과 함께 4 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 지질 소포와 함께 다시 배양합니다.

인 비트로(in vitro) 지질 단백질 극성 복합체 재구성을 위해, 최대 용출액 내의 세라마이드 인산세린(ceramide phosphate serine)에 결합하는 단백질의 SDS-PAGE 및 면역 블로팅 분석을 계속합니다. 앞서 보여드린 것과 같이 vibrant CM-DiI로 염색된 인산세린 세라마이드 소포의 핑크색 펠렛 준비 단계부터 시작하여, 100 µM $\gamma$-S-GTP, 1 mM GDP 및 관심 재조합 단백질 혼합물이 첨가된 100 µL의 TRI 완충액에 소포를 다시 현탁합니다. 그 다음, 4 °C에서 3시간 동안 반응물을 배양합니다. 이어서 20배 농축액인 X-in-V 완충액 5 µL와 X-in-V 접합 자성 비드 50 µL를 첨가합니다.

혼합물을 4 °C에서 완만하게 교반하며 30분 동안 더 배양합니다. 침전을 촉진하기 위해 제조사의 프로토콜에 따라 NX NV 자기 활성 세포 분리를 계속 수행합니다. 용출 분획에 10 µg의 순수 e albumin을 첨가합니다.

Weyl flue 침전법으로 단백질을 농축합니다. 하층은 vibrant cm dii가 농축된 클로로포름 메탄올로 구성됩니다. 갈색의 중간층에는 자성 비드와 침전된 단백질이 포함되어 있습니다.

Weyl-flu 반응의 유기 클로로포름 메탄올 상에서 분홍색으로 선명하게 나타나는 cm dii를 검출하여 ellu 지질 소포를 정량하십시오. 샘플 간 단백질 양을 정규화하기 위해 동일한 양의 지질 소포를 사용하고, SDS page 및 면역 블로팅으로 분석하십시오.

녹색 형광 단백질 또는 세라마이드 결합 도메인이 C-말단에 연결된 전체 길이의 PKC Zetta를 발현하는 MDCK 세포의 계면활성제 제거 용해물입니다. pkc. Zetta의 C-말단은 phospho seine과 함께 배양되었습니다.

세라마이드 소포를 Max 컬럼에서 용출시킨 후, 단백질을 면역 블롯팅으로 분석하였습니다. 세라마이드 결합 단편 C20 Zeta, EGFP 및 전체 길이 PKC Zeta가 Max 컬럼의 용출액(EIT)에서 회수되었으며, 이는 Lyx 절차의 특이성과 효능과 일치합니다. 인산화된 시리아 세라마이드 소포에 결합하지 않은 음성 대조군 EGFP는 용출액(EIT)에서 검출되지 않았습니다.

Linx를 SDS page, western blotting 또는 단백질체 분석과 같은 다른 방법과 병행하면, 지질 결합 단백질 복합체에 어떤 단백질이 포함되어 있는지와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 개발 이후, LabX는 S 단일 지질 연구 분야의 연구자들이 신경 줄기 세포 및 상피 세포에서 세라마이드 유도 아포토시스와 세포 극성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.