환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

본 절차의 전반적인 목적은 토양 또는 퇴비 시료 추출물 내의 효소 가수분해 유기 인을 분류하는 것입니다. 이는 먼저 수산화나트륨 EDTA 용액으로 시료를 추출하고 추출물의 pH를 조절함으로써 수행됩니다. 그 다음, pH가 조절된 추출물을 두 가지 서로 다른 효소 용액과 함께 배양합니다.

96웰 플레이트에서 마지막 단계는 몰리브덴 블루 비색법을 사용하여 효소에 의해 방출된 정인산염을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 대부분의 천연 정인산 모노에스테르 인과 디에스테르 인 형태는 효소 가수분해법에 의한 정인산염의 차등 방출을 기반으로 토양 또는 퇴비 시료 내에서 분류될 수 있습니다. 이 방법은 모든 표준 실험실에서 저렴한 비용으로 수행할 수 있습니다.

인 31 핵자기공명 분광법(phosphorus 31 nuclear magnetic resonance spectroscopy)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은, 향후 토양 내 천연 효소가 유기 완두 화합물로부터 정인산염을 방출할 수 있는 잠재력을 측정할 수 있다는 점입니다. 따라서 이 방법으로 얻은 데이터는 토양 비옥도 또는 토양이 조류가 이용 가능한 유해한 양의 정인산염을 방출할 가능성을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. 50 mL 원추형 튜브에 담긴 2 g의 습식 또는 건식 시료에 0.25 M 수산화나트륨 용액 30 mL를 첨가하십시오.

실온에서 16시간 동안 교반하며 배양합니다. 샘플을 3000 ×g에서 30분 동안 원심분리한 후, 이미 아세테이트 완충액이 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 100 µL를 옮깁니다. 조정된 샘플의 총 부피는 1 mL이며 pH는 5.0입니다.

새로 제조한 0.1 M sodium acetate pH 5 10 mL에 acid phosphatase가 mL당 0.5 unit 함유되도록 stock 용액 두 개를 준비합니다. 이제 Penicillium Citron 유래의 재구성된 lyophilized nuclease NP1을 acid phosphatase stock 용액이 담긴 10 mL 튜브 중 하나에 최종 농도가 mL당 2.5 unit NP1이 되도록 첨가하고, 튜브를 여러 번 뒤집어 부드럽게 혼합한 후 두 효소 용액을 3000 ×g에서 30분 동안 원심분리합니다. 검량선을 작성하기 위해, 먼저 1.5 mL 원심분리 튜브에 1 mM potassium phosphate stock 용액 1 mL를 넣고 0.5 mL씩 7회 연속 희석하며, 첫 번째 튜브는 버려서 최종 희석 범위가 20 µM에서 0.625 nM phosphorus가 되도록 합니다.

이제 ORTHOPHOSPHATE 표준 용액들을 플레이트의 마지막 두 열로 옮깁니다. A행의 0 NM orthophosphate부터 시작하여 H행의 20 nm orthophosphate까지를 10번 열의 처음 세 웰에 넣습니다. 10번 열의 다음 세 웰에는 40 µL의 PP 및 GP 효소 용액을 첨가합니다. 이어서 40 µL의 PP, GP 및 NP 단일 효소 용액을 첨가합니다.

마지막으로, 6개의 모든 웰에 100 millimolar 아세테이트 완충액 40 µL를 첨가합니다. 이제 10번 열의 처음 6개 웰에는 각각 80 µL의 용액이 들어 있어야 합니다. 다음 두 웰에 10 M glucose와 six phosphate가 포함된 소듐 아세테이트 용액 40 µL와 PP 및 GP 효소 용액 40 µL를 첨가합니다.

테스트할 각 샘플에 대해, 모든 샘플의 분주가 완료된 후 pH가 조정된 샘플 추출물 40 µL를 최대 8개 행의 1번에서 9번 웰에 분주합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 1~3열에는 PP 및 GP 효소 용액을, 4~6열에는 PP, GP 및 NP 1을, 7~9열에는 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액을 분주합니다. 모든 샘플이 동일한 배양 시간을 갖도록 이 단계를 신속하게 수행하십시오.

96-웰 플레이트를 덮개로 덮고 시료, 효소 용액, 대조군 및 검량선 시료를 탈이온수가 담긴 37 °C 환경에서 정확히 1시간 동안 배양합니다. 4가지 스톡 용액을 각각 50 mL씩 준비합니다. 용액 A는 멀티채널 피펫을 사용하여 매일 신속하게 조제해야 합니다.

96-웰 플레이트의 모든 웰에 25 µL의 SDS, 100 µL의 용액 A, 20 µL의 용액 B, 그리고 50 µL의 용액 C를 첨가합니다. 플레이트를 덮고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 스프레드시트 프로그램을 사용하여 조정 가능한 마이크로플레이트 리더기로 850 nm에서 흡광도를 측정합니다.

먼저, x축에는 0에서 20 nanomoles phosphorus를, y축에는 두 번 반복 측정한 흡광도의 평균값을 설정하여 무기 인산 검량선을 작성하고, 선형 회귀 분석을 수행하여 최적 적합선의 방정식을 구합니다. 다음으로, 1~3열의 값들을 평균한 후 해당 데이터 세트에 검량선을 적용하여 배경 무기 인산량을 계산합니다. 이어서 가수분해된 인산 모노에스테르 유래 인의 양을 결정하기 위해, 4~6열의 3반복 시료 값들을 평균하고 여기서 대조군 효소 용액 값과 배경 무기 인산량을 뺍니다.

그 후, 가수분해된 인으로부터 인 함량을 계산하기 위해, DER은 7열부터 9열까지의 3반복 시료 값의 평균을 구한 뒤, 4열부터 6열까지의 대조군 효소 용액, 배경 무기 인, 가수분해된 모노 에스테르 인 값을 뺍니다. 일반적인 96웰 플레이트에는 8개 시료의 결과와 검량선이 나타납니다. 대조군은 10열에 있습니다.

1~3번 컬럼과 4~6번 컬럼 사이의 색 강도 증가는 가수분해된 모노에스테르 인 화합물 때문이며, 4~6번 컬럼과 7~9번 컬럼 사이의 증가는 가수분해된 디에스테르 인 화합물 때문입니다. 본 영상에서는 고처리량 효소 가수분해법을 사용하여 버몬트 토양 샘플의 0.25 molar 수산화나트륨 0.05 molar EDTA 추출물 내 인 분류 분포를 성공적으로 분석하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 효소 가수분해를 이용하여 토양 또는 퇴비 추출물 내의 천연 오르토인산염, 모노에스테르 및 디에스테르 인 화합물을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 환경 화학 및 영양 관리 분야의 연구자들이 토양 또는 가축분뇨 시스템 내 유기 P의 거동을 탐구하는 길을 여는 데 도움이 될 수 있습니다.