보조 전기 분무 이온화 질량 분석법 (SESI - MS)를 사용하여 특성화 세균 휘발성 물질

2차 전기 분무 이온화 질량 분석법(Secondary electro spray ionization, mass spectrometry 또는 CS EMS)을 이용하면 시료의 전처리가 전혀 필요 없이 박테리아 휘발성 물질을 분석할 수 있습니다. 박테리아 배양액의 헤드스페이스가 이산화탄소에 의해 cssi 반응 챔버로 치환됩니다. 휘발성 물질이 SSI 반응 챔버를 통과하면서 전기 분무 클라우드를 지나며 이온화됩니다.

이온화된 휘발성 물질은 분석을 위해 질량 분석기로 유입됩니다. 과잉 운반 가스와 반응하지 않는 박테리아 휘발성 물질은 추가적인 보호 조치로서 0.22 micron 필터를 통해 통과하여 박테리아 인자를 제거한 후 화학 흄 후드로 배출됩니다. 궁극적으로, 이 CSI MS 프로토콜은 수 분 내에 박테리아 휘발성 지문을 제공합니다.

우리는 이 기술이 호기 분석을 통한 감염성 질환 진단이나, 식품 표면 또는 내부에 존재하는 병원균을 신속하게 검출할 수 있는 식품 시스템 등 다양한 응용 분야에 활용될 수 있을 것으로 기대합니다. 이 기술은 GC-MS, SIFT-MS 및 PTR-MS와 같은 기존 방법과 비교하여 몇 가지 주요한 장점이 있습니다. 우선, 휘발성 성분을 분석하기 전에 별도의 전처리가 필요하지 않습니다.

둘째로, 휘발성 혼합물 내의 특정 이온을 조각화할 수 있어 화합물 식별이 더 쉬워집니다. 셋째로, 분석 속도가 빠릅니다. 일반적으로 5분 미만이 소요됩니다.

각 시료를 분석하려면, 종의 성장 요구 사항과 질량 분석기로의 휘발성 물질의 효율적인 전달을 고려하여 배양에 적합한 용기를 선택하십시오. 본 시연에서는 표준 100 milliliter pyre 배지 병을 선택하였습니다. 박테리아 휘발성 물질은 운반 가스의 흐름에 의해 질량 분석기로 전달되어 운반체를 구성합니다.

가스 라인을 최소 두 개의 루어 포트(lure port)가 있는 나사형 캡이 달린 배양 병에 연결합니다. 샘플을 배양하기 전에 가스 유입 및 유출 라인을 루어 포트를 통해 삽입하고, 추가 포트는 모두 막습니다. 용기에 압력을 가하고 물에 잠기게 하여 누출 여부를 확인합니다.

가스 누출은 밤새 변동성 이온 신호가 약해지거나 소실되는 형태의 비정형 결과가 발생하는 주요 원인입니다. LB Lennox 배지에서 e coli, K 12 및 pseudomonas aerogen, PAO one을 배양하여 각 종당 두 개의 생물학적 반복 시료를 준비합니다.

50 milliliters의 LB Lennox가 담긴 멸균 배양 병 9개와 대조군(blank)으로 사용할 접종하지 않은 병 1개를 준비합니다. 각 overnight 배양액을 두 개의 샘플 병에 접종하여 기술적 반복 실험군(technical replicates)을 생성합니다. 배양액과 대조군을 37 degrees Celsius에서 24시간 동안 배양합니다. CEMS는 휘발성 물질을 샘플링하도록 특별히 설계되었으므로, 기기를 사용하기 전에는 향이 강한 개인 세정제 제품의 사용을 제한하십시오.

기기 및 가스 이송 라인의 오염을 방지하기 위해 실험실 내의 모든 휘발성 화학 물질의 뚜껑을 닫고, 테스트 중에는 공기의 흐름을 최대한 제어하십시오. 생존 가능한 생물학적 제제를 사용할 경우, 운반 가스 라인에 적절한 공극 크기의 필터를 설치하십시오. 필터는 sesi 반응 챔버로의 휘발성 물질 이송을 방해하지 않으나, 에어로졸 이송 효율에는 약간의 영향을 미칠 수 있습니다.

전압 공급 장치가 꺼져 있고 시스템의 전하가 방전되었는지 확인하려면, 전압 공급 장치의 표시등이 꺼져 있는지 확인하십시오. 멀티미터의 전압이 0인지 확인하고 전기 리드를 접지하십시오. 이때 분석을 위한 전기 분무 용액을 설치하십시오.

양이온 모드에서는 0.1% formic acid, 5% methanol 및 94.9% water로 구성된 전기분무 용액을 사용합니다. 최적의 신호 강도와 안정성을 확보하기 위해 이산화탄소 운반 가스를 켜고 유량을 분당 2 L로 설정하십시오. 전기분무 저장조에 압력을 가하여 전기분무 용액이 초당 5 nL의 유량으로 반응 챔버로 전달되도록 합니다. 그다음 전압 공급 장치를 켜고 전압을 2.5 kV로 조정하십시오.

인가 전압은 신호 이온 강도와 일렉트로스프레이 테일러 콘(Tailor cone)의 안정성에 영향을 미칩니다. 본 시스템의 경우 2~5 kV 사이의 전압에서 양이온 모드 시 최상의 결과가 나타납니다. 이 단계에서 이온화 소스의 금속 표면은 위험한 전기 충격을 줄 수 있으므로 주의하십시오. 이제 SEMS 스펙트럼 모니터링을 위한 튜닝 방법을 설정하십시오.

다중 채널 분석 또는 MCA 체크박스를 해제하십시오. 데이터 수집 시간을 10분에서 15분으로 설정하고 데이터 수집을 시작하십시오. 운반 가스 배경의 스펙트럼을 관찰하고, 안정적인 총 이온 크로마토그램과 재현 가능한 스캔을 얻기 위해 인가 전압을 미세하게 조정하십시오.

기기가 안정화되었는지 확인하기 위해 스펙트럼과 A TIC를 5분 동안 계속 수집하십시오. 실험에 적합한 분석 파라미터를 입력하십시오. 향후 실험을 위해 운반 가스 배경 스펙트럼을 기록하십시오.

공백 스펙트럼을 수집하려면, 먼저 운반 기체 흐름을 바이패스 라인으로 유도한 다음, 밸브가 닫힌 상태의 공백 시료를 기기의 이송 라인에 연결하십시오. 시료 병의 밸브를 열고 바이패스 라인의 밸브를 닫으십시오.

재현 가능한 스펙트럼을 얻기 위해, 반응 챔버 내의 습도가 안정화되는 동안 시스템이 30초 동안 평형 상태에 도달하도록 합니다. 시스템이 평형 상태가 되었는지 확인하려면 TIC를 모니터링하십시오. TIC는 평형 도달 기간 동안 변화하다가 이후 안정화됩니다.

시스템이 평형 상태에 도달하면 스펙트럼 수집을 시작합니다. 스펙트럼 수집이 완료되면, 먼저 운반 가스 바이패스 라인을 열고 그 다음 샘플 밸브를 닫아 샘플 병을 제거합니다.

마지막으로, 시료 병을 제거합니다. 이송 라인에서 수분과 흡착된 휘발성 물질을 제거하고 시료 간의 오염(carryover)을 방지하기 위해 운반 가스로 시스템을 2~4분 동안 플러싱합니다. 각 세균 시료의 휘발성 핑거프린트 데이터를 수집하며, 철저한 블랭크 차감(blank subtraction)을 보장하기 위해 추가적인 블랭크 스펙트럼을 간헐적으로 수집합니다.

LB Lennox 배지에서 37°C로 24시간 동안 호기성 배양한 E. coli와 P. aerogen의 양이온 모드 휘발성 지문 분석 결과는 서로 구별됩니다. E. coli의 휘발성 스펙트럼은 질량 대 전하비(m/z) 118의 indu가 주를 이루는 반면, Pseudomonas aerogen의 스펙트럼은 더 다양한 단백질 부가 피크를 포함하고 있습니다.

본 절차를 수행하는 동안, 인가 전압, 전기 분무 용액 조성, 운반 가스 유량과 같이 분석을 위해 최적화한 기기 파라미터를 기록하는 것이 중요합니다. 또한, 향후 분석을 재현할 수 있도록 대표 스펙트럼 기록을 유지하는 것이 중요합니다. 병원성 박테리아 및 고전압을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

따라서 실험 중에는 css CMS에 대한 접근을 제한하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다. 이제 귀하의 시스템에서 박테리아 휘발성 물질에 대한 CSS, EMS 스펙트럼을 재현 가능하게 얻을 수 있을 것입니다. 행운을 빕니다.