세포 세포 상호 작용을 조작에 대한 실리콘 마이크로 칩

안녕하세요, 저는 Elliot Hu입니다. 저는 이곳 매사추세츠 공과대학교(MIT)의 Tia 교수님 연구실에서 박사후 연구원으로 근무하고 있습니다. 오늘은 실리콘 마이크로 기계 칩 상에 세포 배양을 준비해 보겠습니다. 이 장치들은 서로 맞물리는 작은 빗 모양으로 생겼으며, 이를 통해 두 개의 서로 다른 세포 집단 간의 상호작용을 정밀하게 조절할 수 있습니다.

오늘은 간의 간세포와 이를 지지하는 기질 세포 간의 상호작용에 대해 연구하겠습니다. 구체적으로, 3T3 섬유아세포를 콤(comb)의 상단 표면에 배양하여, 콤의 손가락 부분을 이동시킴으로써 세포를 움직이고 공간적 배치를 변경할 수 있습니다. 각 장치는 두 부분으로 나뉘어 있으며, 두 가지 가능한 구성으로 결합할 수 있습니다.

첫 번째 조건은 두 세포 집단을 서로 접촉하게 합니다. 두 번째 조건은 두 집단을 약간 분리하여 세포가 서로 닿지 않게 합니다. 이 경우 접촉 상호작용은 차단되지만, 분비 인자를 통한 상호작용은 유지됩니다.

먼저 핀셋을 사용하여 부품을 다루는 방법에 대해 알아보겠습니다. 저는 큰 테플론 핀셋과 끝이 둥근 작은 금속 핀셋을 모두 사용하는 것을 선호합니다. 큰 핀셋을 사용할 때는 이와 같이 부품의 가장자리를 잡을 수 있으며, 팔(arm)이 있는 큰 부품의 경우 팔 부분이 매우 약하므로 부러지지 않도록 주의해야 합니다.

이런 식으로 부품의 뒷부분을 집어 올리십시오. 금속 핀셋을 사용하여 구멍 안으로 손을 뻗어 칩을 직접 집어 올릴 수 있습니다. 크기가 큰 부품은 12-웰 플레이트의 벽면에 맞고, 크기가 작은 부품은 24-웰 플레이트에 맞거나 큰 부품과 짝을 이룰 수 있습니다.

12-웰 플레이트에서는 보통 금속 핀셋을 사용합니다. 플레이트 내의 부품들을 서로 결합시키기 위해 다룰 때, 보통 더 큰 부품을 웰에 먼저 넣고 한쪽 끝까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 보완용 수리 부품을 웰의 반대편에 놓고, 두 개의 핀셋을 각각의 구멍에 넣어 서로 밀어 결합시킵니다.

이제 부품들을 간격 구성(gap configuration) 또는 접촉 구성(contact configuration)의 상태로 서로 고정할 수 있습니다. 부품을 분리하려면, 부품들을 간격 구성 상태로 당긴 다음 수직으로 들어 올려 제거하는 방식을 권장합니다. 현재 소자들은 실리콘으로 제작되었으므로, 적절한 세포 부착을 위해 코팅 처리가 필요합니다.

장치는 이미 폴리스티렌으로 코팅되고 플라즈마 처리가 된 상태로 제공될 가능성이 높으므로, 이를 시작점으로 가정하겠습니다. 우선, 간세포가 부착될 표면을 코팅하기 위해 콜라겐을 사용하겠습니다. 간세포 콤(hepatocyte comb)을 50 µg/mL 콜라겐 I 용액에 넣고 37 °C에서 45분 동안 배양합니다.

반면에 섬유아세포 콤(fibblast combs)은 코팅할 필요가 없습니다. 배양 후, 콜라겐 용액을 흡입하여 제거하고 물로 세척합니다. 이제 ES를 보완 부품과 접촉시켜 함께 고정함으로써 세포 파종을 위한 평평한 표면을 형성하겠습니다.

먼저, 일부 웰에 70% ethanol을 채웁니다. 각 웰에 한 쌍을 넣고 서로 결합시킵니다. 결합 후에는 현미경으로 부품들을 관찰하여 평면이 일치하는지 확인해야 합니다.

가끔 부품들이 정렬되지 않은 상태로 결합될 수 있습니다. 이 경우 현미경으로 보면 부품들이 서로 다른 초점 평면에 놓여 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이때는 단순히 부품을 분리한 후 다시 결합하십시오. 정렬 상태가 적절한지 확인한 후, 멸균을 위해 부품들을 에탄올에 잠시 담가 둡니다.

대개 시간이 촉박하므로 10분 동안만 침지합니다. 멸균 후에는 헹궈내야 합니다. 에탄올을 완전히 흡입하여 제거하고 물로 세척한 다음, 다시 흡입하고 물로 세척합니다. 마지막으로 물을 흡입하여 제거하고 배양액으로 교체합니다.

이제 장치에 세포를 파종하겠습니다. 일반적으로 세포를 500,000 cells/mL 농도로 현탁하며, 12웰 플레이트를 사용하여 각 콤 쌍(comb pair) 위에 현탁액 1 mL를 피펫으로 분주합니다. 여기서는 두 개의 웰에 섬유아세포를 500,000 cells/mL 농도로 파종하였습니다.

마찬가지로, 웰당 500,000개의 간세포 현탁액을 취하여 나머지 두 개의 웰에 분주하였습니다. 이제 배양하기 전에, 세포가 고르게 분포되도록 충분히 흔들어 줍니다. 저는 수직으로 세 번, 수평으로 세 번 흔드는 과정을 총 세 번 반복하는 방식을 선호합니다.

흔들어준 후 인큐베이터에 넣고 세포를 15분 동안 둡니다. 그 후 다시 한번 흔들어줍니다. 1시간 동안 15분 간격으로 흔드는 과정을 반복한 다음, 세포 현탁액을 흡입하여 제거하고 새로운 세포 현탁액을 넣습니다. 세포가 완전히 합쳐져 단층(confluent layer)을 이룰 때까지 이 과정을 반복합니다.

일반적으로 섬유아세포의 경우 1~2회 정도 분주하며, 간세포의 경우에는 2~4회 정도 분주할 수 있습니다. 합류성 단일층(confluent monolayer)을 형성하기 위해 세포를 상당히 높은 밀도로 분주하며, 흔들어 줌으로써 세포가 고르게 분포되도록 합니다.

1차 파종 후, 세포의 성긴 층이 형성됩니다. 세포가 폴리스티렌과 콜라겐이 코팅된 손가락 부분에만 부착됨을 확인하십시오. 신선한 세포를 다시 파종하고 15분마다 흔들어주며 1시간 동안 추가로 배양하면, 세포 층이 더 조밀하게 성장합니다.

세 번째 파종 후 세포 밀도가 적절해지면, 콤(comb) 위에 세포를 파종한 단계에서 중단합니다. 이제 세포를 원하는 실험 구성으로 조작하고자 합니다. 장치는 이제 보완 부품과 분리하여 24시간 동안 배양합니다.

24시간 후, 세포들이 퍼져 콤 표면에 합쳐진 단층(confluent monolayer)을 형성합니다. 이제 공동 배양을 형성하고자 합니다. 간세포 콤과 섬유아세포 콤을 동일한 웰로 옮겨 원하는 초기 구성으로 함께 고정합니다.

원하는 경우, 일정 시간이 지난 후 구성을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 18시간 후에 갭(gap) 구성으로 전환할 수 있는데, 이때 부품들을 동일한 위치에 배치하고 갭 구성에 도달할 때까지 밀착시킨 다음, 다시 갭 구성으로 밀어 넣어 접촉시킵니다.

이제 콤 하나를 제거하겠습니다. 지금부터 기존의 폴리스티렌 코팅을 제거하고, 칩을 세척한 다음, 새로운 폴리스티렌 코팅을 입혀 세포 배양을 위한 준비 과정을 진행하겠습니다. 다시 한번 말씀드리지만, 기존의 폴리스티렌 코팅을 벗겨내고 새로 코팅함으로써 이전 실험의 이력이 새로운 실험에 영향을 주지 않도록 보장합니다.

실험을 마친 후, 가장 먼저 세포를 표백하고 콤(comb)을 물로 헹구어 냅니다. 칩을 튜빙에 넣기 전에 칩이 완전히 말랐는지 확인해야 합니다. 여기 잠시 동안 자연 건조시킨 몇 개의 콤이 있으며, 완전히 건조되었는지 확인하고 있습니다.

이제 톨루엔을 약간 취해 이 유리 비커에 넣겠습니다. 톨루엔은 플라스틱을 녹이므로, 일반적인 폴리스티렌 피펫은 사용할 수 없기 때문에 여기서는 유리 피펫을 사용하겠습니다.

이제 충분합니다. 이제 이 부품 몇 개를 톨루엔에 넣고, 쉐이커를 켜서 교반하겠습니다. 톨루엔이 증발하는 것을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 2시간 후면 톨루엔이 빗(comb)에 묻은 폴리스티렌 대부분을 녹였을 것이며, 이제 빗을 꺼내어 공기 중에서 건조시키면 됩니다.

할로젠 린스 후에 부품들에 폴리스티렌이 거의 남아 있지 않고 비교적 깨끗한 상태여야 합니다. 하지만 새로운 폴리스티렌 층이 잘 접착되게 하려면 부품들이 매우 깨끗해야 하며, 그렇지 않을 경우 세포들이 당기기 시작할 때 실험 중간에 폴리스티렌이 벗겨지는 경향이 있습니다.

이제 피라냐 용액(piranha acid) 세척을 진행하겠습니다. 부품들을 유리 비커에 넣었으며, 이를 가열할 것입니다. 따라서 핫플레이트 위에 올리겠습니다.

여기 황산과 과산화수소수가 있습니다. 먼저 황산을 붓겠습니다. 이때 모든 칩이 액체 아래로 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 칩이 떠오르는 경향이 있을 때가 있습니다.

또한 현재 상당히 부식성이 강한 화학 물질을 다루고 있으므로, 적절한 보호구를 착용했는지 확인하십시오. 여기서는 니트릴 장갑을 착용했습니다. 이제 산에 과산화수소를 부을 것인데, 발열 반응이 일어나므로 주의하시기 바랍니다.

반응하면서 약간의 연기가 발생하는 것을 볼 수 있는데, 시스템에 에너지를 더해 반응성을 더욱 높이려고 합니다. 이제 온도를 120 °C까지 올릴 것이며, 현재 약 120 °C에 도달했습니다. 이를 통해 칩에 남아 있는 세포 배양 잔해물이 완전히 제거될 것임을 확신할 수 있습니다. 이 시점에서는 모든 과산화수소가 소비될 때까지 반응이 완전히 끝날 때까지 그대로 두시면 됩니다.

그 시점에서 혼합물의 기포 발생이 멈추게 됩니다. 따라서 반응이 완료되기까지 약 30분이 소요됩니다. 기포가 더 이상 보이지 않으면 핫플레이트 전원을 끄고 식히면 됩니다.

이제 샘플들을 BAK 곡수(BAK curve water)로 옮기겠습니다. 여기서 다시 한번 금속 핀셋이 아닌 테플론 핀셋을 사용하고 있는지 확인하십시오. 핀셋으로 샘플을 집어 옮기면 됩니다. 이제 DDH₂O의 일정한 흐름 아래에서 헹궈내겠습니다. 저는 보통 메인 라인에서 직접 연결하여 최소 10분 동안 계속 흘려보냅니다.

그렇게 함으로써, 다진 후 10분 동안 흐르는 물에 씻어 산의 모든 흔적을 제거하겠습니다. 칩에서 산이 완전히 제거되어야 하며, Sigma에서 구입한 분자량 45,000의 polystyrene을 코팅할 준비가 될 때까지 칩을 물속에 보관하겠습니다. 이제 소량을 여기서 측정하겠습니다.

400 mg의 시료가 있으며, 이를 100 mg/mL 농도로 톨루엔에 용해할 것입니다. 따라서 톨루엔은 반드시 흄후드 내에서 취급해야 합니다. 또한, 폴리스티렌을 용해하기 위해 톨루엔을 사용하므로, 폴리스티렌 재질의 실험 도구를 사용하지 않도록 주의해야 합니다.

여기서는 폴리프로필렌 원추형 튜브와 유리 피펫을 사용합니다. 폴리스티렌 400 mg을 가지고 있으므로, 톨루엔 4 mL를 넣겠습니다. 이제 폴리스티렌이 용해될 때까지 30분 동안 볼텍싱하겠습니다. 이제 가장 낮은 속도로 약 20분에서 30분 동안 튜브를 볼텍싱하겠습니다.

이제 튜브를 볼텍스 믹서에 고정하겠습니다. 내내 잡고 있을 필요는 없습니다. 20~30분 후면 폴리스티렌이 용해되어 코팅 준비가 완료될 것입니다.

이제 저희 시설에서 폴리스티렌을 스핀 코팅하겠습니다. 스핀 코터는 클린룸 시설 내에 있습니다. 따라서 여기서는 캡, 고글, 가운, 덧신, 그리고 장갑을 착용해야 하지만, 귀하의 시설에서는 규정이 다를 수 있습니다.

이 척을 사용하기 전에 폴리스티렌으로부터 보호하고자 합니다. 따라서 알루미늄 호일로 덮을 것이며, 칩이 표면에 밀착되어 놓일 수 있도록 표면에 최대한 평평하게 붙여야 합니다. 칩에 진공 상태를 유지할 수 있도록 정중앙에 작은 구멍을 뚫어줍니다.

스핀 코더를 2,400 RPM, 30초로 설정합니다. 이제 칩 하나를 가져와 칩의 중심이 구멍을 덮도록 배치합니다. 폴리스티렌을 올릴 때는 처음에 진공을 끈 상태로 두고, 그 다음 진공을 켠 뒤 스핀을 시작합니다. 크기가 작은 부품의 경우, 10방울보다 약간 적게 넣으면 됩니다.

더 큰 부품의 경우에는 폴리스티렌을 10방울보다 약간 더 많이 사용합니다. 그리고 이를 2,400 RPM에서 30초 동안 회전시킵니다. 이제 폴리스티렌이 코팅된 칩을 꺼내어 120 °C의 오븐에 넣습니다. 이 온도는 폴리스티렌의 유리 전이점보다 높은 온도입니다.

따라서 표면을 다시 녹여 약간 매끄럽게 만들고, 플라스틱의 밀도를 높이며 경화시킵니다. 그래서 보통 하룻밤 동안 오븐에 넣어 둡니다. 이 과정이 완료되려면 최소 몇 시간은 소요될 것입니다.

하룻밤 동안 베이킹을 마친 칩은 이제 플라스마 처리 준비가 되었습니다. 폴리스티렌을 산소 플라스마에 노출시키면 표면 에너지가 변화하여 단백질과 세포의 부착력이 향상됩니다. 칩을 플라스마 챔버에 넣고 진공 상태가 되도록 펌핑합니다.

권장 설정은 진공도 200 milTorr, 출력 200 W이며, 산소 가스 흐름 하에 1분 동안 유지하는 것입니다. 시스템의 진공 배기가 완료되었으므로, 이제 산소를 주입하겠습니다. 이제 RF 전원을 켜고 1분 동안 플라스마를 발생시킵니다.

플라즈마가 작동하면 실제로 빛이 납니다. 마치 형광등과 같습니다. 1분 동안 플라즈마에 노출시킨 후, 압력을 다시 대기압으로 올리면 부품을 꺼낼 수 있습니다.

이제 부품들이 단백질 코팅과 세포 주입을 위한 준비가 되었습니다. 이 장치를 설계한 목적은 조직의 미세 구조를 동적인 방식으로 조작할 수 있도록 하기 위함이었습니다. 따라서 체내 조직의 미세 조직화, 특히 세포들이 서로에 대해 배치되는 위치는 실험실 배양에서 각 특정 세포의 기능을 결정하는 데 매우 중요합니다.

최근까지 우리는 이를 적절히 재현하는 데 어려움이 있었으나, 지난 5년 또는 10년 사이에 세포를 조직 배양 기질 위에 마이크로 패턴으로 배열할 수 있게 되었으며, 이를 통해 조직 배양 플레이트 내에서 우리가 원하는 정확한 위치에 세포를 배치할 수 있게 되었습니다. 이러한 과정을 통해 마이크로 규모에서 세포 간 상호작용의 기초 생물학에 관한 몇 가지 중요한 측면들을 발견할 수 있었습니다. 하지만 지금까지 우리가 구현하지 못한 것은 이를 동적으로 수행하는 것입니다.

이는 실험 중간에 세포 배양의 조직 구성을 변경하는 것입니다. 이는 생체 내 조직이 실제로 정적인 환경이 아니기 때문에 중요합니다. 특히 상처 치유나 발생 과정에서는 세포가 이동하고 재구성됩니다.

하지만 항상성 상태의 정상적인 장기에서도 많은 요소들이 계속해서 움직이고 있습니다. 습득하기 가장 어려운 기술적 측면은 단순히 각 부품을 물리적으로 조작하는 방법입니다. 처음 시스템을 다루기 시작할 때는 부품들이 얼마나 취약한지, 혹은 조작해야 하는 움직임이 얼마나 미세한지에 대해 겁을 먹을 수도 있습니다.

하지만 잠시만 연습해 보신다면 큰 어려움 없이 사용하실 수 있을 것이라고 생각합니다. 예를 들어, 이 장치가 역할을 할 수 있는 분야 중 하나인 배아 발달 과정에서, 세포가 다양한 배아 층을 통해 싹트면서 일련의 서로 다른 세포 환경과 접촉하게 됩니다. 그리고 이러한 층들과 순차적으로 접촉하며 발생하는 상호작용이 세포를 특정 분화 경로로 계속해서 밀어낸다는 사실이 알려져 있습니다.

따라서 저희는 이러한 유형의 장치가 실험실에서 해당 유형의 이벤트를 재현하는 데 유용할 수 있다고 생각합니다. 저희가 특히 살펴보고자 했던 미세 조직화의 한 측면은, 세포막이 서로 맞닿을 수 있는 접촉 상호작용을 통한 세포 간 통신과, 주변 배지로 분비되어 조금 더 멀리 떨어진 세포로 확산되는 수용성 인자를 통한 통신의 차이였습니다. 많은 경우, 세포들이 공동 배양되어 서로에게 영향을 미칠 때, 이러한 역할이 접촉 상호작용에 의한 것인지 아니면 분비된 인자에 의한 것인지가 명확하지 않았습니다.