β - glucuronidase (거스)을 기반으로 세포를 파괴 분석

본 절차의 전반적인 목적은 Gus 리포터 시스템을 사용하여 특정 유전자의 잠재적인 세포 사멸 특성을 분석하는 것입니다. 관심 유전자를 Gus 카세트에 클로닝하고 35 s 프로모터 하의 적절한 아그로박테리움 벡터에서 배양합니다. 이후 이 벡터들을 아그로박테리움 균주 LBA 44 0 4에 형질전환시키고, Gus 발현 카세트를 포함하는 배양물과 혼합하여 *Nicotiana hamana* 잎에 침투시킵니다.

Gus 활성은 조직화학적 염색을 통해 시각적으로 평가하거나, 형광 측정 mug 분석법을 통해 정량적으로 평가할 수 있습니다. DNA laddering이나 tunnel 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 포유류 시스템에서는 흔히 사용되지만 식물에서는 재현하기 어려운 반면, 이 방법은 살아있는 세포가 있어야 gas 발현이 일어난다는 단순한 사실을 이용한 민감하고 신속한 식물 기반 일시적 분석법이라는 점입니다. 오늘은 Hua RAO를 사용하여 해당 절차를 시연하겠습니다.

우리 실험실의 박사후 연구원인 Infiltration 단계에서는 25 °C에서 재배한 3~6주령의 건강하고 완전히 확장된 nicotiana hamana 잎이 필요합니다. 이 프로토콜은 8일에 걸쳐 수행하도록 계획하십시오. 1일 차에는 세포 사멸 분석용 벡터와 Gus 발현 카세트가 포함된 벡터의 agrobacterium tumor fassan 글리세롤 스톡을 플레이트에 스트리킹합니다. 여러 배양 조합을 테스트할 때는 항상 음성 대조군 또는 스터퍼(stuffer)로 빈 벡터를 포함하십시오.

플레이트를 28°C에서 2일 동안 배양합니다. 3일째에, 각 플레이트에서 단일 콜로니를 채취하여 2 mL의 선택적 LB 배지에 접종합니다. 최대 성장 밀도에 도달할 때까지 28°C에서 200 RPM으로 24시간 동안 진탕 배양합니다.

24시간 동안 배양한 후, 덩어리가 져 있다면 피펫팅을 통해 배양물을 완전히 재현탁하고, 아그로박테리움(agrobacterium)의 병원성 유전자를 유도하기 위해 신선한 선택 LB 배지를 사용하여 각 배양물의 총 부피를 10 milliliters로 늘립니다. 아세톤을 25 micromolar 농도로 첨가하고, 각 배양물을 28 degrees Celsius에서 16시간 동안 더 진탕 배양합니다. 다음 단계로, 각 배양물을 상온에서 4,000 Gs로 10분 동안 원심분리한 후, 펠릿을 10 milliliters의 침투 배지에 재현탁합니다.

아세톤을 추가하지 말고 배양액을 다시 원심분리하십시오. 그 다음, 100 µM 아세톤이 포함된 침투 배지 5 mL에 각 펠릿을 재현탁하십시오. 이제 600 nm에서 OD를 측정하십시오.

0.1만큼 낮은 농도도 허용되지만, 0.9보다 높을 경우 침투 전 침투액, 배지와 아세톤으로 0.9까지 희석하십시오. 배양 후 28 °C에서 3시간 동안 진탕 배양하며 다시 한번 배양하십시오. 실험군 배양액과 대조군 배양액을 Gus 카세트가 포함된 배양액과 1:1 비율로 혼합하십시오.

각 배양체에 대해, 1 mL 무침 주사기를 사용하여 ABA 밀봉 부위 또는 새로 돋아나는 잎의 뒷면에 침투시키십시오. 침투 부피는 중요하지 않습니다. 수분 흡수 구역이 충분히 형성될 때까지 첨가한 후, 동일한 식물의 서로 다른 잎에 음성 대조군과 분석할 유전자를 각각 침투시키고, 동일한 방식으로 두 개 더 많은 식물에 침투시키십시오.

따라서 각 배양 조건당 세 개의 반복 식물을 준비합니다. 침투 후 3일이 지나면 잎을 수집하여 gust 단백질 발현을 분석할 때입니다. 잎 전체가 완전히 젖을 때까지 xlu 기질을 진공 침투시켜 조직 화학 분석을 시작하십시오.

이제 잎을 실온의 암소에서 하룻밤 동안 또는 뚜렷한 청색 염색이 나타날 때까지 배양합니다. 청색 염색이 확인되면 잎을 증류수로 헹구고, 엽록소가 제거될 때까지 70% ethanol에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 잎을 증류수로 헹군 후 GUS 발현 수준을 평가합니다.

Gus 발현량을 정량화하기 위해, 기질 mug를 형광 생성물 mu로 전환하여 측정합니다. 먼저 액체 질소를 사용하여 침투시킨 잎 디스크를 막자사발로 갈아줍니다. 그 다음, 샘플을 얼음 위에 둔 상태에서 100 µL의 GUS 추출 버퍼를 첨가합니다. 이제 현탁액을 4 °C에서 14,000 ×g로 5분 동안 원심분리하고, Gus를 포함한 총 가용성 단백질이 함유된 상층액을 수집합니다.

NanoDrop을 사용하여 총 가용성 단백질 농도를 측정하고, Gus 추출 완충액 내 각 시료의 농도를 총 단백질 100 µg이 되도록 조정합니다. 이제 각 시료에 Gus 추출 완충액에 녹인 mug 기질을 최종 농도가 2 mM mug가 되도록 첨가합니다. 시료당 총 부피 100 µL가 적당하며, 피펫팅으로 충분히 혼합한 후 37 °C에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.

1시간 후, 800 µL의 GUS 정지 버퍼를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. GUS를 정량하기 위해 각 샘플 100 µL를 마이크로타이터 플레이트에 로딩하고, 플레이트 리더를 사용하여 분석합니다. 365 nm 들뜸 파장과 455 nm 방출 파장에서 형광을 측정하여 표준 곡선과 비교합니다. 이후 GUS 활성을 총 가용성 단백질 1 µg당 분당 µmol의 활성으로 보고할 수 있습니다. GUS 발현 카세트를 세포 사멸의 음성 조절 인자 또는 항사멸 유전자와 함께 공동 침투시켰을 때, 사용된 컨스트럭트에 따라 다양한 GUS 수준이 검출됩니다.

비교 결과, 높은 Gus 수준이 관찰됩니다. 공 벡터 대조군(empty vector control)의 Gus 수준은 훨씬 낮습니다. 반대로, 세포 사멸의 양성 조절자 또는 전-사멸 유전자(pro-death gene)를 사용하면, 공 벡터 대조군과 비교하여 Gus 발현이 현저히 감소하는 것이 관찰됩니다.

이 기술에 숙달되면 약 일주일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 본 기술이 특정 유전자의 잠재력을 결정하기 위한 초기 단계로 사용된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 초기 결과를 확인하고 관련된 세포의 유형을 결정하기 위해 추가적인 작업이 필요합니다.