개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

상피 조직의 유지에는 장벽 기능을 저해하지 않으면서 손상되거나 사멸하는 세포를 지속적으로 제거하는 과정이 필요합니다. 이를 위해 상피 세포는 사멸하는 세포 주변의 세포들에서 액틴과 미오신 링을 형성하고 수축시켜, 사멸 세포를 배출함과 동시에 세포 배출로 인해 발생할 수 있는 틈새를 메우는 방식으로 사멸 세포를 밀어냅니다. 본 비디오 논문에서는 제브라피쉬 유생의 표피에서 세포 사멸에 의한 세포 배출을 유도하고 이를 실시간으로 이미징하는 방법을 소개합니다.

본 영상에서는 표피에 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬 배아의 한 세포 단계에 적색 형광 단백질로 표지된 F actin 프로브를 주입하여 상피 조직 내의 액틴 필라멘트를 시각화하는 방법을 보여줍니다. GFP와 RFP를 모두 발현하는 수정 후 4일 된 자어에 G418을 처리하여 표피의 세포 사멸을 유도합니다. 세포 배출 과정 중에 발생하는 액틴 역학과 상피 세포의 형태 변화는 스피닝 디스크 공초점 현미경을 이용한 타임랩스 이미징으로 시각화합니다.

면역 힘 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 살아있는 상피 조직 내에서 세포 압출 과정 중에 일어나는 급격한 변화와 액틴 역학을 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 영상에서는 발생 중인 제브라피쉬의 표피에서 세포 사멸 세포가 압출되는 과정을 실시간으로 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 세포들이 장벽 기능을 유지하면서 세포 사멸 세포를 제거하기 위해 어떻게 액틴 세포골격을 협력적으로 재배치하는지, 그리고 이러한 압출 과정의 저해가 어떻게 특정 질병 상태로 이어질 수 있는지를 이해하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 발달 중인 제브라피시 표피의 세포 압출 과정 동안 액틴 역학을 시각화하려면, 먼저 이전에 전사된 RNA를 얼음 위에서 해동하십시오. 우리는 utrophin의 calponin homology 도메인과 액틴 결합 단백질에 융합된 적색 형광 단백질을 인코딩하는 mRNA를 전사합니다. 최종 RNA 농도가 약 30 ng/µL가 되도록 RNA에 phenol red를 1:1 비율로 첨가하고, 역충전 방식을 통해 1 µL의 용액을 당겨 만든 모세관 바늘에 로딩합니다.

E3 버퍼 내에서 약 75개의 1세포기 C-K-G-F-P 배아를 수집합니다. 수집한 배아를 5.75분 후두 파스퇴르 피펫으로 미세주입 몰드에 옮기고, Dumont No. 5 핀셋을 사용하여 배아를 홈에 조심스럽게 배치합니다. 일반 실험실용 해부 입체 현미경 하에서 작업하며, 여러 단계의 배아에 RNA를 주입하는 일이 없도록 신속하게 진행합니다.

압력 제어식 마이크로 인젝터를 사용하여 배아의 난황에 RNA를 주입합니다. 주입 후 배아에서 붉은색이 보여야 합니다. 각 실험당 최소 50개의 배아에 주입하십시오.

수정되지 않았거나 손상된 알을 제거하기 위해 배아를 선별하고, 남은 모든 배아를 28 degrees Celsius에서 배양합니다. 24시간 후, 형광 해부 현미경을 사용하여 표피에 높은 수준의 GFP 형광과 RFP 라벨링된 actin 형광이 나타나는 제브라피쉬 배아를 선택합니다. 선택된 배아를 28 degrees Celsius에서 배양하며, 아미노글리코사이드 노출을 통해 세포 사멸을 유도하는 약물 처리 단계 전까지 유지합니다.

항생제 G 418 또는 약물은 발달 중인 제브라피쉬 치어의 표피에서 세포사멸 세포의 탈락을 유도합니다. 중요한 점은, 이 처리가 세포 탈락을 유도하기 위해서는 수정 후 4일 된 치어 또는 그 이상의 연령에서만 효과가 있다는 것입니다. GFP와 RFP를 모두 발현하는 수정 후 4일 된 제브라피쉬 치어를 최대 25마리까지 수집하여 3 mL의 E3 배지가 담긴 35 x 10 mm 배양 접시에 넣습니다.

배지를 1 mg/mL의 G four 18이 포함된 E three 3 mL로 조심스럽게 교체하고, 28 °C의 암조건에서 4시간 동안 유충을 약물에 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 0.02% trica가 포함된 예열된 E three 배지로 교체한 후, 이미징을 위한 유충 마운팅 단계를 진행합니다. 최대 3마리의 유충을 1.5 mL fendor 튜브로 옮기고 E three 배지를 대부분 제거합니다.

절단된 피펫 팁을 사용하여 1% low melt agarose 120 µL를 튜브에 넣고 혼합합니다. 그 후, 유충과 agarose 혼합물을 Matech 배양 접시 바닥의 커버 글라스 위에 조심스럽게 피펫팅합니다. 삽입 핀이나 텅스텐 바늘이 장착된 FST 핀 홀더를 사용하여, 유충이 커버 글라스에 일직선으로 평평하게 밀착되도록 빠르게 방향을 잡습니다.

아가로스를 응고시킵니다. 그 다음 0.02% trica가 포함된 E3 배지로 디쉬를 조심스럽게 채웁니다. 발달 중인 제브라피쉬 유생의 표피에서 세포 사멸 세포가 밀려 나오는 전체 과정은 약 20분이 소요됨을 확인하였습니다.

본 영상에서는 스피닝 디스크 공초점 현미경과 and or IQ 소프트웨어를 사용하여 제브라피시 표피의 단일 층을 관통하는 일련의 Z-평면을 수집하는 타임랩스 이미징 실험 설정 방법을 시연합니다. 먼저, and or IQ 소프트웨어 내에서 아르곤 및 헬륨-네온 레이저, 현미경 카메라 및 에피 형광 램프의 전원을 켭니다. 이미지 촬영에 사용할 파장들이 포함된 타임 시리즈 프로토콜을 생성합니다.

이미지 캡처 간격의 빈도와 캡처 반복 횟수를 설정합니다. 시편이 담긴 mattec dish를 현미경 스테이지 위에 조심스럽게 놓고, 투과광과 20배 대물렌즈를 사용하여 유충에 초점을 맞춥니다. 40배 수침 대물렌즈를 정확한 위치로 이동시킵니다. 이 대물렌즈를 사용하면 시야당 약 20~25개의 세포를 촬영할 수 있어, 세포 내 actin 역동성을 분해하며 압출 과정 중의 세포 행동을 추적할 수 있습니다.

40배 대물렌즈 상단에 물 한 방울을 조심스럽게 떨어뜨린 후, 그 위에 mattec dish를 빠르게 올립니다. 명시야 조명을 사용하여 시료를 확인한 다음, 488 nanometer 에피 형광을 이용하여 GFP 양성 표피에 구체적으로 초점을 맞춥니다. 공초점 스캐닝 모드로 전환합니다.

각 채널에 맞춰 레이저 강도와 노출 시간을 조정하십시오. 신호를 최적으로 검출하고 광독성을 방지할 수 있도록 레이저 출력과 노출 시간의 균형을 맞추는 데 주의하십시오. 돌출되는 세포를 식별하려면, 에피 형광(epi fluorescence)을 사용하여 GFP로 표지된 표피를 시각화하고, 중앙의 작은 원형 세포를 둘러싼 세포 집합체로 구성된 전형적인 로제트 패턴의 세포군을 찾으십시오.

또한, 세포 압출의 특징인 중앙의 작고 둥근 세포 주변으로 링 형태의 RFP 표지 액틴 축적이 관찰되어야 합니다. 압출되는 세포가 확인되면, Z 시리즈의 상한 및 하한 값과 스텝 크기를 신속하게 설정하십시오. 그런 다음 4D 공초점 데이터 세트 획득을 시작하여 데이터를 확인하고, 액틴 링의 수축 및 사멸하는 세포 주변에서 발생하는 상피 세포의 거동을 시각화하십시오.

시간 경과에 따라 Z-시리즈의 3D 투영 영상을 제작하고 데이터를 동영상 파일로 저장하십시오. 이 단계는 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 그림은 수정 후 4일 된 CK GFP 제브라피쉬 유생의 표피에서 RFP UTR CH의 발현을 보여줍니다.

여기 실시간 작용 역학을 추적한 타임랩스 영상의 정지 화면 Z-프로젝션이 있습니다. 상피세포 압출 과정이 나타나 있으며, 화살표는 인접한 세포들에 의해 형성된 액틴 링을 나타냅니다. 이 링은 2분 동안 수축하며 닫힙니다. 이 절차 이후, 압출의 변화가 어떻게 특정 질병 상태로 이어지는지 더 잘 이해하기 위해 화학적 억제제 사용이나 유전적 돌연변이 유도와 같은 다른 방법들을 이 기술과 병행하여 사용할 수 있습니다.

세포 사멸 세포의 제거 실패로부터 기인하여, 우리는 방금 발달 중인 제브라피쉬의 표피에서 일어나는 배출 과정을 시각화하기 위한 타임랩스 이미징 실험 설정 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 광퇴색이나 독성을 방지하기 위해 시료에 노출되는 빛의 양을 제한하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.