절연, 환기 및기구 마우스 폐의 특성화는 타악기 흐름 Perfused

맥동성 폐압-혈류 관계를 연구하기 위함입니다. 본 프로토콜에서는 마우스 폐를 적출하고 환기 및 관류시키는 방법을 설명합니다. 환기를 위해 기관을 외과적으로 노출시킵니다.

그 다음 심장과 폐를 적출하여 폐동맥과 좌심방에 캐뉼라를 삽입할 수 있도록 합니다. 이어서 폐 계통에 관류를 실시합니다. 폐동맥 혈류의 크기, 파형 및 빈도를 변경하여 실험을 수행합니다.

결과로 얻어진 폐동맥 및 좌심방 압력 파형을 기록하여 박동성 폐압-혈류 관계를 확인합니다. 생체 내(in vivo) 준비법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 체액량 상태, 교감신경계 톤, 활성 및 마취 효과의 변화 없이도 박동성 압력-혈류 관계의 변화를 얻을 수 있다는 점입니다.

또한, 대부분의 고립성 폐 표본 제작 방식은 정적인 압력-유량 관계만을 측정하는 반면, 본 기술을 이용하면 박동성 압력-유량 관계를 결정할 수 있습니다. 이 방법은 폐혈관 질환이 박동성 폐 혈역학에 어떤 영향을 미치는지, 또는 폐동맥의 경직도 증가가 우심실 후부하에 어떤 영향을 주는가와 같은 폐 생리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 심장과 폐를 노출하고 폐동맥에 캐뉼라를 고정하는 과정은 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

기구로 인한 과도한 압력은 폐부종을 유발할 수 있으며, 캐뉼라의 부적절한 배치는 폐동맥을 천공시킬 수 있습니다. 실험을 시작하기 전, 격리된 폐의 환기 및 관류에 사용되는 IL one 시스템을 준비해야 합니다. 튜빙은 압력 트랜스듀서에 연결되어야 합니다.

단일 펌프와 유량계를 사용하여 시스템을 37°C로 가온된 증류수로 완전히 세척하고 튜브 내의 기포를 제거하십시오. 그 다음 Endur tech 펌프 튜브를 1% PBS로 프라이밍하십시오. 이제 영점을 조절합니다.

먼저 IL one 시스템으로 향하는 밸브를 닫고 대기 방향의 밸브를 열어 각 P 75 트랜스듀서의 압력을 조절합니다. 그런 다음 plug SIS 앰프를 사용하여 압력을 자동으로 영점 조정합니다. 동물을 준비하기 전, 세라믹 다공성 조각을 증류수에 담가 IO one 장치의 습도를 유지하십시오. 마우스를 마취시킨 후, 앞발을 코르크 보드에 고정하여 수술을 위한 안정 상태를 유지합니다.

이제 가슴 부위에 95% alcohol을 분무합니다. 직선 핀셋을 사용하여 목 부분의 피부를 잡고 직선 가위로 1cm 크기의 절개창을 만듭니다. 목 내부가 노출되면 식도와 기도를 찾으면서 표면 근육에 있는 흰색 선 조직을 절제합니다.

식도와 기관 주변 및 후방의 조직을 분리하고, 기관 주위에 느슨하게 봉합사를 묶습니다. 기관에 캐뉴를 삽입하기 위해 소형 가위로 기관의 한쪽 면에 작은 V자 모양의 절개를 조심스럽게 냅니다. 이제 둔결포셉(blunt forceps)을 사용하여 마우스를 IL one 시스템으로 옮깁니다.

기관 캐뉼라를 잡아 기관 속으로 밀어 넣습니다. 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다. 먼저 실온 공기로 환기를 시작하고, 가슴에 알코올을 뿌린 후 직선 핀셋과 직선 가위로 피부를 제거합니다.

흉골을 따라 피부를 위쪽으로 절개합니다. 양쪽의 피부를 들어 올리고 아래쪽 갈비뼈 라인을 따라 절개합니다. 이제 핀셋으로 검상돌기를 잡고 볼팁 가위를 사용하여 흉골 하단과 맞닿은 횡격막에 구멍을 냅니다.

횡격막을 잡아 갈비뼈에서 절단합니다. 볼 팁 가위(ball tipped scissors)를 사용하여 검상돌기를 다시 잡고, 폐, 심장 또는 혈관이 손상되지 않도록 주의하며 갈비뼈를 통해 흉골을 위쪽으로 절개합니다. 심장을 노출시키기 위해 왼쪽 갈비뼈를 잡고 그 끝부분을 절단합니다.

이제 우심실에 0.1 mL의 heparin을 천천히 주입하십시오. 주입 후, 나머지 갈비뼈를 절단합니다. 현미경 하에서 갈비뼈를 절단하는 동안, 포셉의 뒷부분이나 둥근 끝을 사용하여 폐를 갈비뼈에서 조심스럽게 밀어내십시오. 심장 상단의 지방 속에 있는 선 조직을 제거합니다.

핀셋을 사용하여 조직을 당겨 제거하고 다듬어 줍니다. 스프링 가위를 사용하여 대동맥과 폐동맥 주위에 봉합사를 배치하고, 뭉툭한 핀셋으로 심장을 조심스럽게 떠내듯 들어 올립니다. 이때 저항이 거의 없어야 합니다.

이제 더블 throw 방식으로 느슨하게 봉합합니다. 다음으로 하복부를 절개하여 제거합니다. 각도가 진 가위를 사용하여 갈비뼈와 척추까지 절개합니다.

이 과정에서 상당량의 혈액이 흐를 수 있습니다. 면봉을 사용하여 혈류를 지혈하십시오. 지혈이 완료되면 10 mL의 RPMI가 충전된 주사기를 사용하여 4 mL의 RPMI로 IL 시스템을 프라이밍하십시오.

튜브 내부에 기포가 없는지 다시 한번 확인하는 것이 좋습니다. 이제 심첨부 근처에 작은 절개물을 만들어 캐뉼라를 삽입하여 우심실에 캐뉼라를 거치하십시오. 폐동맥에 도달할 수 있도록 아래쪽으로 조준하십시오. 프로브의 팁이 거의 투명한 폐동맥 벽을 통해 보여야 합니다.

그런 다음, 좌심실에 캐뉼라를 삽입하기 위해 캐뉼라, 대동맥 및 폐동맥 주변의 봉합사를 조입니다. 심첨부에 작은 절개창을 내고 좌심방을 향해 위쪽으로 캐뉼라를 삽입합니다. 판막을 찾기 위해 약간의 압력이 필요할 수 있으나, 판막을 찾으면 캐뉼라가 미끄러지듯 들어가 봉합사 없이도 안정적으로 고정됩니다.

유출 튜브에서 흐름이 보일 때까지 10 milliliter 시린지에서 RPMI를 분당 0.3 milliliters의 속도로 수동 주입하십시오. 유출 튜브에 흐름이 없다면 좌심실 캐뉼라의 위치를 다시 조정하십시오. 하지만 폐에 흐름이 없다면 폐동맥에 누출이 있을 가능성이 높으므로 실험을 중단하십시오.

심장의 캐뉼라 삽입이 완료되었으므로, 60 mL 주사기를 IL 1 시스템에 연결합니다. 정속 유량 펌프를 사용하여 RPMI Perfuse 8을 1 mL/min의 속도로 주입합니다. 초기 관류 중에 누출 여부를 확인하십시오.

폐가 하얗게 변할 때까지 2분 동안 서서히 관류합니다. 맥동류 연구의 경우, 먼저 단일 펌프 피스톤 변위량을 원하는 수준으로 설정하십시오.

그런 다음 정상 유량을 설정하십시오. 이제 osli 펌프 밸브를 열고 osli 유량 프로필을 실행하기 직전에 데이터 기록을 시작하십시오. 작업이 완료되면 데이터 출력 파일을 열고 초기 시험의 실험 유량을 바탕으로 실험 유량을 도식화하십시오.

각 주파수에서 진동 펌프 피스톤 변위를 조정하여 Q max를 원하는 수준으로 맞춥니다. 데이터 수집 동안 환기압을 일정하게 유지하십시오. 정체류 실험을 위한 데이터 수집 시, 단독 펌프의 밸브를 닫고 정체 유량을 원하는 수준으로 설정합니다. 데이터 기록을 시작하고 정체류 프로토콜의 단계를 수행하십시오.

각 시험 사이의 유량에서 최소 10초 동안 데이터를 수집하십시오. 유량을 0.5 milliliters per minute로 재설정하십시오. 데이터 수집 중에 환기압을 일정하게 유지해야 합니다.

좌심방압을 0으로 설정하여 실험하고자 하는 경우, 실험 중에 유출 튜브를 제거하십시오. 기도 튜브 내로 RPMI가 유입되는지 주의 깊게 관찰하십시오. RPMI가 기도압 트랜스듀서에 도달하면 장비가 손상될 수 있으므로 절대 유입되지 않도록 해야 합니다.

다음은 다양한 조건 하에서 상단 행의 유량 Q와 그에 따른 두 번째 행의 폐동맥 및 좌심방 압력을 측정한 정상 상태 유동 관류 결과입니다. 처음 두 패널에서는 유출 튜브가 설치되어 있었기 때문에 Q에 따라 좌심방 압력이 증가하고 감소했습니다. 첫 번째 패널은 호기 말 공기압과 흡기 시 압력을 나타내며, 두 번째 패널은 호기 말 공기압을 나타냅니다. 다음으로, 튜브를 제거하여 좌심방 압력이 Q와 무관하게 일정하게 유지되도록 했습니다. 그 후 유출 튜브의 높이를 수동으로 조절하여 좌심방 압력을 높였습니다.

다시 Q와는 무관하게, 첫 번째 패널은 호기 말 공기압과 흡기압을 보여주며, 두 번째 패널은 호기 말 공기압을 보여줍니다. 각 경우에 대한 결과적인 정상 상태의 폐동맥압-혈류 관계는 압력 대 혈류 그래프를 그려 얻을 수 있습니다.

상단 패널에는 유량 Q를 이용한 박동성 흐름 관류 결과와 그에 따른 폐동맥, 좌심방 및 공기압이 나타나 있습니다. 하단 패널에서는 이러한 박동성 폐압-흐름 관계로부터 총 우심실 후부하를 반영하는 폐혈관 임피던스를 계산할 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 20분에서 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 손이 떨리지 않도록 시간을 충분히 갖고 마음을 편하게 갖는 것이 중요합니다. 폐에 혈류가 충분히 공급되면 어려운 단계는 끝난 것입니다.

이 절차 이후에, 폐 맥동압 유량 관계에서 관찰된 변화에 어떤 분자적 기전이 관여하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 폐 조직에 대한 조직학적 분석이나 생화학적 분석과 같은 다른 기술들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 폐 생리학 분야의 연구자들이 유전자 변형 마우스를 이용하여 폐혈관 질환의 발생 및 진행 과정에서 특정 유전자와 단백질의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.