라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

이 실험 절차의 목적은 형광 프로브인 TMRM과 H 2D CFD를 각각 사용하여 일차 피질 신경세포의 미토콘드리아 막 전위와 활성 산소종 수치를 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 TMRM과 H 2D CFDA의 스톡 및 작동 농도를 준비합니다. 두 번째 단계는 Thai roads 버퍼 내에서 실온으로 45분 동안 피질 신경세포를 TMRM 및 H 2D CFDA와 함께 배양하는 것입니다.

세 번째 단계는 각각 515/517 nm 및 488/515 nm의 여기/방출 파장을 사용하여 살아있는 피질 뉴런에서 TMRM과 DCF의 형광 강도를 이미지화하는 것입니다. TMRM 형광의 변화는 미토콘드리아 언커플러인 FCCP 존재 하에 모니터링하며, DCF 형광의 변화는 과산화수소 존재 하에 모니터링합니다. 이 절차의 마지막 단계는 데이터의 수집, 정규화 및 분석입니다.

최종적으로, FCCP 및 과산화수소 처리 전후의 TMRM 및 DCF 형광 강도 상대 수치를 각각 그래프로 그려 결과를 얻습니다. 안녕하세요, Joanna Koska입니다. 로욜라 시카고 대학교의 저희 연구실에 오신 것을 환영합니다.

오늘은 쥐의 피질 뉴런에서 미토콘드리아 막 전위와 활성 산소종을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 실험 절차는 dhi가 시연하겠습니다. 안녕하세요, 저는 Denise Jossi입니다.

본 절차를 통해 단일 미토콘드리아 표지에서 미토콘드리아 막 전위를 측정하고, 단일 세포 표지에서 활성 산소종을 측정할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 5 mg의 TMRM을 1 mL의 무수 dimethyl sulf oxide에 녹여 10 mM TMRM 스톡 용액을 준비하고 1분 동안 볼텍싱하십시오.

그런 다음 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 빛으로부터 보호하고 한 달 이내에 사용하십시오. 다음으로, 4.87 mg의 H 2D CFDA를 1 mL의 무수 dimethyl sulf oxide에 녹여 10 mM의 H 2D CFDA 스톡 용액을 준비하십시오.

마찬가지로 1분 동안 볼텍싱한 다음, 소분하여 -20°C에서 보관하십시오. 빛을 차단하여 보관하고, 일주일 이내에 쥐의 피질 뉴런에 TMRM을 먼저 로딩하는 데 사용하십시오. 배양된 뉴런을 Tyro's buffer로 3회 세척하십시오.

그 다음 10 millimolar TMRM 스톡 용액을 tb로 1000배 희석하여 20 nano molar TMRM을 준비합니다. 그런 다음 tb 1 milliliter당 희석된 TMRM 2 microliters를 첨가합니다. 뉴런을 TMRM과 함께 상온의 암소에서 45분 동안 배양합니다.

45분 후, 배양 접시를 현미경 스테이지 위에 올리고 쥐 피질 뉴런에 H 2D CFDA를 로딩하기 위한 이미징을 시작하며, 배양된 뉴런을 tb로 3회 세척합니다. 다음으로, 10 millimolar H 2D CFDA 스톡을 tb로 10배 희석하여 2 micromolar H 2D CFDA를 준비합니다. 그런 다음 tb 1 milliliter당 희석된 H 2D CFDA 2 microliters를 첨가합니다.

그 후, 뉴런을 H 2D CFDA와 함께 상온의 암소에서 45분 동안 배양합니다. 이미지를 얻기 전, 과량의 형광 지시약을 제거하기 위해 뉴런을 TB로 4 번 세척합니다. 라이브 타임 시리즈 프로그램을 적용하여 TMRM로 배양한 뉴런의 라이브 이미징을 수행하기 위해 공초점 레이저 주사 현미경을 사용합니다. 이미지 획득에 소요되는 시간을 최소화하고 광퇴색을 방지하기 위해 저해상도와 감쇠된 레이저 출력을 적용합니다.

다음으로, 반사광을 사용하여 TMRM이 로딩된 장착 뉴런의 초점을 조정합니다. 514 nm에서 조사하고 570 nm에서 검출하여 TMRM 형광을 확인합니다. 해상도, 레이저 출력, 카메라 게인 및 이미지 획득을 위한 타임랩스 간격을 포함한 모든 파라미터가 설정되면, 카메라의 검출 게인을 포화 수준 바로 아래로 설정합니다.

실험 사이에 이 설정들을 변경하지 마십시오. 다음으로, 필드를 변경하십시오. 1 µM의 FCCP 또는 2 µg/mL의 oligomycin을 처리하여 미토콘드리아 막 전위를 각각 유의미하게 탈분극 또는 과분극시킬 수 있으므로, delta PSY M 자극의 변화를 테스트하기 위해 이미지 수집을 시작하십시오.

이러한 변화는 FCCP의 경우 기저 형광 강도 대비 TMRM 형광 강도의 감소로, 또는 TMRM 형광 강도의 증가로 나타납니다. H 2D CFDA와 함께 배양된 뉴런의 라이브 이미징을 수행하려면, 먼저 배양 접시를 현미경 스테이지에 고정하고 반사광을 사용하여 세포의 초점을 조정하십시오. 4 88 nanometers에서 들뜨게 하고 five 15 nanometers에서 방출되는 DCF 형광을 관찰하십시오.

다음으로, 레이저 출력을 5~7%로 조정하고 게인(gain)과 해상도를 256 x 256으로 설정하십시오. 실험 간에 이 설정들을 변경하지 마십시오. 그런 다음 라이브 이미지를 얻기 위한 빈도를 설정하십시오.

Time series 프로그램을 사용하여 새로운 시야를 선택하고, ROS 수준의 변화를 검출하기 위해 이미지 획득을 시작합니다. 세포를 100 내지 200 µM의 과산화수소로 처리합니다. 이는 기저 수준과 비교하여 DCF 형광 강도의 증가로 나타납니다.

LSM 프로그램의 관심 영역(ROI) 도구를 사용하여 영역을 선택합니다. 그런 다음 이미지 셀에서 미토콘드리아 영역의 ROI 또는 전체 세포체의 ROI를 선택합니다. 이를 통해 각각 TMRM 또는 ROS의 형광 강도를 측정합니다.

세포 옆의 영역을 선택합니다. 배경 형광 강도를 계산하기 위해 여러 번 측정하고, Microsoft Excel을 사용하여 각 시점별 각 세포의 관심 영역 평균 형광 강도에서 평균 배경 형광 강도를 빼어 평균 배경 강도를 계산합니다. 배경 강도를 뺀 후, TMRM 또는 DCF 형광 강도를 기선 형광 값으로 정규화합니다.

이 공식을 사용하여 Sigma plot 프로그램을 통해 시간에 따른 형광 강도의 변화를 나타내는 그래프를 생성하십시오. 다음은 TMRM과 함께 배양된 쥐의 피질 뉴런 형광 이미지의 예시입니다. F-C-C-P-A 미토콘드리아 언커플러(uncoupler)를 첨가하면 미토콘드리아 탈분극이 일어나며 TMRM 형광 강도가 감소합니다.

FCCP를 첨가하기 전까지 TMRM 형광의 기저 수준은 안정적으로 유지됩니다. 시간에 따른 TMRM 형광 변화의 정량적 분석 결과, FCCP 첨가 후 TMRM 형광이 유의미하게 감소하는 것으로 나타났습니다. 다음은 DCF가 로딩된 쥐 피질 뉴런의 형광 이미지 예시입니다.

과산화수소 처리를 하기 전 처음 120초 동안 baseline DCF 형광 수준은 변하지 않고 유지됩니다. 과산화수소를 첨가하면 세포체 내의 DCF 형광 강도가 증가합니다. DCF 형광의 타임랩스 측정 결과, 과산화수소 처리 후 형광 수준이 증가한 상태로 일정하게 유지됨을 보여줍니다.

본 절차에서는 광퇴색 및 광독성으로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 낮은 레이저 출력과 빠른 스캔 속도를 사용하는 것이 중요합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.