사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

이 실험 절차의 전반적인 목표는 동물 및 분리된 세포 모두에서 막 복구 능력을 평가하는 것입니다. 분리된 골격근 섬유를 수집하고 FM 1 43 염료가 포함된 배지로 둘러쌉니다. 그 다음 UV 레이저를 사용하여 세포막의 일부를 조사하고 손상시켜 염료가 세포 내로 들어갈 수 있도록 합니다.

분리된 세포에 GFP MG 53을 발현하는 플라스마 DNA를 transfection하면, 이는 세포의 세포막과 세포질에 위치하게 됩니다. 그 후 마이크로 전극의 팁을 C two C 12 막에 삽입하여 손상을 유도합니다. 최종적으로, 손상 부위로 GFP MG 53이 전이되는 것을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

미세 전극 삽입과 근섬유 분리 기술을 숙달하는 데 필요한 실무가 중요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 필수적입니다. 절차 시연은 저희 실험실 매니저인 Dr.Lin, 박사후 연구원 Dr.Wazu, 대학원생 Matt Orange, 그리고 저희 학과의 연구 조교수인 Dr.Shaza가 진행하겠습니다. 우선, 실험 중 동물로부터 발생하는 노폐물을 수집할 수 있도록 트레드밀 아래에 트레이나 파란색 실험실 패드를 놓으십시오.

다음으로, 트레드밀 표면의 각도를 설정합니다. 일부 트레드밀에는 경사도를 조절하는 통합 장치가 있으며, 다른 제품의 경우 다른 수단을 통해 트레드밀을 높여야 합니다. 일반적으로 평평한 표면이나 내리막 또는 오르막 7~15도 사이의 각도가 사용됩니다.

전기 그리드를 끈 상태에서 벨트 구동 모터만 켠 채로 마우스를 트레드밀 위에 올려놓아 적응시킵니다. 15분의 적응 기간이 지난 후, 동기 부여를 위한 전기 그리드를 켭니다. 트레드밀을 분당 약 5m의 초기 속도로 시작합니다. 매분 속도를 1~2m/min씩 높이며 동물이 5분 동안 워밍업 시간을 갖도록 합니다.

테스트 중 순응도를 높이기 위해 이 웜업 기간을 3일에서 10일 동안 매일 반복하십시오. 급성 탈진 운동을 수행하려면, 최대 속도에 도달할 때까지 트레드밀의 속도를 점진적으로 높이며 탈진 징후를 모니터링하십시오.

동물이 트레드밀 밖에서 시간의 절반 이상을 보내거나 그리드 위에서 5초 연속으로 멈춰 있을 때 탈진한 것으로 간주합니다. 탈진한 마우스를 제거하고 총 주행 시간을 기록하십시오. 지구력 훈련.

러닝 프로토콜은 모두 동일한 웜업 절차로 시작합니다. 다만, 최대 속도는 일반적으로 더 낮으며 러닝 시간은 상당히 길 수 있습니다. 테스트 후 마우스를 홈 케이지로 돌려보내고 트레드밀을 70% ethanol로 세척하십시오.

추가 분석을 위해 발의 천지굴근(flexor digitorum brevis muscle) 표층을 분리합니다. 먼저, 하부의 근육이 손상되지 않도록 주의하며 발바닥의 중앙선을 따라 피부를 절개합니다. 그다음, 수평으로 절개하여 피부를 제거합니다.

종골에 부착된 FDB 근육의 납작하고 흰 힘줄을 확인합니다. 핀셋을 사용하여 힘줄을 분리한 다음, 부착 부위 근처에서 힘줄을 절단합니다. 결합 조직을 잘라내면서 힘줄을 부드럽게 위로 당깁니다.

원위 건이 각 손가락으로 분지되는 지점을 찾습니다. 건이 심층 근육층과 연결되는 부위를 절단하여 FDB를 제거합니다. FDB 근육 다발을 37 °C로 예열한 1 mL의 콜라게나제 용액에 넣습니다.

튜브를 37 °C 오비탈 쉐이커에 수평으로 테이프로 고정하고 200 RPM으로 65분 동안 흔들어 줍니다. 충분히 소화되면 외관이 풀어지고 색이 옅어집니다. 소화된 다발이 통과할 수 있도록 1 mL 피펫 팁의 끝부분을 잘라냅니다.

번들을 2.5. Calcium tyro 약 600 µL가 들어 있는 원심분리 튜브로 쉽게 옮깁니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 번들에서 떨어진 섬유들이 섞이도록 흔들어 줍니다.

다음으로, 30 µL 피펫 팁의 끝부분을 잘라 직경이 근섬유 다발보다 약간만 작게 만듭니다. 이 팁을 사용하여 다발을 피펫 안으로 빨아들인 다음 다시 용액 속으로 밀어 넣습니다. 섬유의 대부분이 다발에서 분리될 때까지 이 과정을 반복합니다.

튜브를 부드럽게 돌려 분리된 섬유를 혼합합니다. 필요한 양을 취해 glass bottom delta T dish에 떨어뜨립니다. 남은 섬유는 추후 사용 및 추가 연구를 위해 4 °C에서 약 6시간 동안 보관하십시오.

디쉬를 5분 동안 그대로 둡니다. 이렇게 하면 섬유가 디쉬의 유리 바닥에 부착됩니다. 유리 바닥 디쉬를 UV 레이저가 장착된 공초점 현미경 위에 놓습니다.

100배 이상의 배율로 위상차 현미경을 통해 섬유를 관찰하여 정상적인 가로무늬 패턴과 직선형 막대 모양의 형태가 있는지 확인합니다. FM 1 43 또는 FM 4 64 styro perineum 염료를 최종 농도가 2.5 micromolar가 되도록 용액에 첨가합니다. 손상을 유도하기 위해 섬유를 시야의 왼쪽 상단에서 오른쪽 하단으로 45도 각도가 되도록 배치합니다.

세포막의 5x5 픽셀 영역에 조사합니다. 최대 출력으로 설정한 UV 레이저를 5초 동안 사용하여, 조사된 영역이 세포막을 분리하도록 하며, 5x5 상자의 절반은 섬유 내부에, 나머지는 섬유 외부에 위치해야 합니다. 최대 5분 동안 5초 간격으로 섬유 내부로 염료가 유입되는 이미지를 캡처합니다. 형광 염료가 결국 섬유 내부로 내세포작용(endocytose)되어 데이터 분석을 복잡하게 만들 수 있으므로, 디쉬당 최대 3개의 섬유만 조사해야 합니다.

광섬유 3개를 사용한 후에는 새로운 디쉬를 준비해야 합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여, 광섬유 간의 비교를 위해 약 200 square microns 면적의 형광 강도 변화를 계산하십시오. 각 프레임에 대해 delta F 나누기 F zero로 계산하며, 여기서 F zero는 첫 번째로 캡처된 프레임 내 관심 영역의 평균 형광 값이고 delta F는 이후 각 프레임에서의 형광 변화량입니다.

표준 방법을 사용하여 GFP MG 53을 발현하는 플라스미드 DNA를 세포에 형질전환합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 준비합니다. 마이크로 피펫에 Pyrex 모세관을 장착합니다.

설정된 프로그램에 따라 풀링(pulling)을 수행합니다. 마이크로 피펫을 3축 마이크로 조작기 배양 장치에 부착합니다. delta T 디쉬에서 배지를 제거하고 2.5 millimolar calcium tyro buffer로 교체합니다.

형질전환된 세포가 담긴 디쉬를 40 x 1.3 NA 오일 침전 렌즈가 장착된 레이저 주사 공초점 현미경 위에 놓습니다. 마이크로 피펫을 세포막에 삽입한 후 빠르게 다시 빼내어 급성 살아있는 세포 손상을 유도합니다. 트로포닌으로 유도된 막 파괴에 대해 프레임당 1.54초 간격으로 연속적인 살아있는 세포 이미지를 수집합니다.

이미징 중인 세포 바로 위에 약 1 mL/min의 속도로 0.005% troponin을 관류합니다. 트레드밀을 사용하여 달리기 능력의 감소를 측정할 수 있습니다. 여기에서 보이는 MG 53 knockout 마우스는 골격근 손상으로 인해 달리기 능력이 감소되어 있습니다.

UV 레이저로 인한 손상 정도는 관찰되는 섬유의 막 회복 능력에 따라 달라집니다. 여기 정상 마우스에서 손상 전의 섬유 모습입니다. 이 이미지는 200초 후에 촬영된 것으로, 약간의 손상이 발생했음을 보여줍니다.

막 수선 능력이 손상된 MG 53 녹아웃 마우스 유래 근섬유는 손상 후 더 현저한 염료 유입을 보입니다. 여기는 손상되지 않은 GFP MG 53 형질전환 C2C12 근관의 예시입니다. 이 이미지의 화살표는 손상 부위로 이동하는 GFP MG 53 함유 소포를 가리킵니다.

본 예시에서는 사포닌을 사용하여 세포막을 손상시켰습니다. 손상 후 GFP MG 53이 세포질에서 세포막으로 전위되는 것을 확인하십시오. 이 절차를 수행할 때는 매끄러운 근초막과 뚜렷한 가로무늬 패턴을 가진 양질의 근섬유를 분리하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청하고 나면, 근육의 막 복구 능력을 평가하는 방법과 세포 배양법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.