3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

본 실험의 목적은 3D 조직 유사 스테로이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 세포를 회수하고 단일 세포 현탁액을 생성함으로써 수행됩니다. 그다음, 세포 현탁액 방울을 조직 배양 접시의 뒤집힌 뚜껑 아랫면에 도포합니다.

그런 다음 뚜껑을 뒤집어 수화 챔버 위에 덮습니다. 마지막 단계는 응집체가 형성될 수 있도록 현탁 방울(hanging drops)을 24~48시간 동안 배양하는 것입니다. 이후 이를 진탕 수조로 옮겨 최대 5일 더 배양할 수 있습니다.

최종적으로, 응축 분석, 조직 표면 10 대칭성 또는 에피 형광 현미경 검사를 통해 응집체 응집력이나 세포 분류의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 기존의 2D 조직 배양과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 3D에서 배양된 세포가 조직 환경 내의 세포가 겪는 세포 간 상호작용을 더 밀접하게 모방한다는 것입니다. 이제 PI조차도 수행할 수 있을 만큼 이 방법이 매우 간단하다는 것을 보여드리기 위해 시연하겠습니다.

이 실험을 시작하려면, 90% 합류도(confluency)에서 부착 세포를 수확하십시오. 먼저, 배양액을 흡입하여 제거하고 PBS로 세포 시트를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 단층 세포층 위에 0.05% trypsin-EDTA 용액 2 mL를 피펫으로 분주합니다.

플레이트를 37 °C 조직 배양 인큐베이터에 넣고 세포가 떨어져 나올 때까지 배양합니다. 다음으로, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내어 효소 처리를 중단시킵니다. 완전 배지 2 mL를 첨가합니다.

5 mL 피펫을 사용하여 세포가 완전히 부유될 때까지 혼합물을 트라이투레이션(tritrate)합니다. 그다지 세포 부유액을 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 10 mg/mL DNA 용액 40 µL를 세포 부유액에 피펫팅하여 넣고, 상온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.

세포 현탁액을 짧게 볼텍싱한 후 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 흡입하여 제거하고, 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁하여 세척합니다. 원심분리 과정을 반복하고 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁합니다.

다음으로, 자동 세포 계수기 또는 혈구 계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 배지를 이용하여 세포 현탁액의 최종 농도를 2.5 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 그 후, 행잉 드롭(hanging drop) 형성을 진행합니다.

60 millimeter 조직 배양 접시의 뚜껑을 제거하고 접시 바닥에 5 mL의 PBS를 피펫팅하여 보습 챔버를 준비합니다. 플레이트의 뚜껑을 뒤집어 뚜껑 안쪽에 세포 현탁액을 20~10 µL 방울 형태로 피펫팅합니다. 이때 방울들이 서로 닿지 않도록 충분한 간격을 두고 배치하십시오.

드롭 배양액이 담긴 덮개를 PBS가 들어 있는 접시 바닥 위에 조심스럽게 다시 덮습니다. 배양 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 37 °C, 5% carbon dioxide 및 95% humidity로 설정하고 하룻밤 동안 배양합니다.

매일 드롭(drop)을 관찰하고 세포 시트나 응집체가 형성될 때까지 배양을 계속합니다. 세포 시트나 응집체가 형성되면, 이를 3 mL의 완전 배지가 들어 있는 라운드 바텀 유리 쉐이커 플라스크로 옮깁니다. 세포 시트나 응집체가 담긴 플라스크를 진탕 항온수조에서 배양합니다.

스테로이드 형성이 해부 현미경으로 관찰될 때까지 약 24시간 동안 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 유지합니다. 스테로이드가 형성되면, 서면 프로토콜에 기술된 절차에 따라 스테로이드 형성에 미치는 실험적 조작의 효과를 정량화할 수 있습니다. 또한, 이전에 포함시킨 형광 염료의 막 삽입 여부를 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.

이 명시야 현미경 이미지는 hanging drop 방법을 사용하여 18시간 동안 배양한 후의 쥐 전립선암 MLL 세포 응집을 보여줍니다. 이 이미지는 hanging drop 방법을 사용하여 18시간 동안 배양한 후 형성된 MLL 세포의 두 번째 응집체를 보여줍니다. 이 세포들은 25 µM의 MEK 억제제 PD 9 8 0 5 9 존재 하에 배양되었으며, 그 결과 세포 응집체가 상당히 더 조밀하게 형성되었습니다.

여기에서는 MEK 억제제를 처리한 MLL 현수 적하 배양(hanging drop culture)의 응집체 크기와 처리하지 않은 대조군 응집체 크기 간의 차이를 보여줍니다. 별표(*)는 P 값이 0.0001 미만으로 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 나타냅니다. 이는 처리하지 않은 응집체와 MEK 억제제를 처리한 응집체 간의 student T-test를 통해 결정되었으며, MEK 억제제 처리가 응집체의 크기를 유의미하게 작고 더 조밀하게 만든다는 것을 시사합니다.

이 이미지는 Nikon Smz 800 실체 현미경을 사용하여 촬영되었으며, 병아리 배아 간 세포를 18시간 동안 행잉 드롭(hanging drop) 배양하고, 이후 37 °C의 진탕 수조에서 48시간 동안 배양하여 형성된 스테로이드를 보여줍니다. 이 공초점 현미경 이미지는 행잉 드롭 방법을 사용하여 특정 세포군을 공동 배양했을 때 나타나는 분류(sorting out) 행동을 입증합니다. 행잉 드롭 배양을 진행하기 전, 병아리 배아 간 세포는 pkh two 세포막 인터코팅 염색약으로 염색되었습니다.

심장 세포를 PKH 26으로 염색하였습니다. 그 후 세포 현탁액을 혼합하여 행잉 드롭(hanging drop)법으로 분주하였습니다. 18시간 동안 배양한 후, 37 °C의 진탕 항온수조에서 48시간 동안 추가로 배양하였습니다.

광학 단면을 통해 노란색으로 염색된 심장 세포들이 간 세포들에 의해 둘러싸여 있음을 확인할 수 있습니다. 여기에서 파란색으로 가상 채색된 것은 표면에 NCA를 발현하는 두 개의 nardi 및 transfection된 L 세포 클론입니다. 2.4 대 1의 비율로, 동일한 비율로 혼합된 형광 막 통합 염료인 PKH 2와 PKH 26으로 염색되었으며, 앞서와 동일하게 행잉 드롭(hanging drop) 방식으로 배양되었습니다.

본 예시에서는 녹색으로 의사 색상 처리된 고발현 E-cadherin 세포들이 빨간색으로 의사 색상 처리된 저발현 E-cadherin 세포들에 의해 둘러싸여 있습니다. 숙련된 후 적절하게 수행한다면, 이 기술은 30분 이내에 완료할 수 있습니다.