형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

이 영상에서는 특정 단백질 활성에 미치는 화학적 또는 환경적 요인의 영향을 평가하기 위해, 화학 라이브러리의 고처리량 스크리닝이나 환경 오염 물질 검출에 사용되는 형광 CL gans 균주의 배양 및 분주 방법을 보여줍니다. CL elgan의 경우, 먼저 웜의 먹이로 사용할 박테리아 배양물을 준비하고 GFP 형질전환된 동기화된 웜을 배양합니다.

그 후 0.5~2백만 마리의 벌레를 수집하여 세척하고 3개의 84-well 마이크로타이터 플레이트에 분주한 다음, 화학 라이브러리의 소분자 또는 물, 식품, 토양과 같은 테스트 시료를 벌레에 첨가합니다. 마지막으로 마이크로플레이트 리더를 사용하여 벌레의 형광을 측정합니다.

형광 강도의 데이터 분석을 통해 유도성 전사 경로를 조절하거나 환경 오염 물질의 검출을 가능하게 하는 소분자를 찾아낼 수 있습니다. in vitro 및 세포 배양 기반 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 in vivo에서 독성이 있거나 비활성 상태인 화합물에 시간을 낭비하지 않는다는 점입니다. 이러한 고처리량 방법은 다양한 유도성 경로를 조절하는 소분자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

본 연구진은 소분자 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 위해 이 방법을 개발하였으나, 식품 및 환경 시료 내 오염 물질의 바이오센싱에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차의 시연은 본 연구실의 기술원인 Andrew Dine과 박사후 연구원인 Q long이 담당합니다. 박테리아 웜 푸드를 미리 준비하십시오.

50 µg/mL의 streptomycin이 첨가된 500 mL의 terrific broth에 5 mL의 포화된 e coli OP 50을 접종하는 것으로 시작합니다. 배양액을 쉐이커에 넣고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 배양액을 50 mL 튜브 10개에 나누어 담습니다. 그런 다음 튜브를 냉장 원심분리기에 넣고 2,500 RCF에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 각 박테리아 펠릿을 10 mL의 액체 선충 성장 배지 또는 NGM에 재현탁합니다.

현탁액을 수평으로 흔들어 줍니다. 바닥 진탕기를 사용하여 15분 동안 세균을 재현탁시키십시오. 다음으로, 세균 배양액을 4°C에서 2,500 RCF로 20분 동안 원심분리합니다.

NGM을 따라내고 박테리아 펠렛의 무게를 측정합니다. 그 후 동일한 부피의 NGM 버퍼를 추가하고 볼텍싱하여 펠렛을 재현탁합니다. 마지막으로, 재현탁된 박테리아 배양액 3 mL를 15 mL 튜브에 분주하고 필요할 때까지 -20 °C에서 보관합니다.

본 시연에서는 스트레스를 유도하는 Xeno Duke loan이 전사 인자인 Sskn one에 미치는 영향을 예시로 측정합니다. Sskn one은 산화 및 제노스(xenobi) 스트레스 상황에서 세포 보호 유전자를 활성화하는 것으로 알려져 있습니다. 두 개의 형광 컨스트럭트를 보유한 Trenchgenic c gans 라인 VP 5 96의 대량 배양액을 준비합니다.

VP 5 96 벌레는 전사 인자의 활성을 모니터링하는 데 사용되는 GFP를 발현시키는 GST four 프로모터와, 벌레 수의 정규화를 위한 표준으로 사용되는 RFP를 발현시키는 Sskn one 및 DOP three 프로모터를 모두 발현합니다.

DOP three는 도파민 수용체의 프로모터이며 신체 전반의 뉴런에서 구성적으로 발현됩니다. 예시에서 xenobi lon이 sskn one을 강력하게 활성화하고 GS T four 프로모터로부터 발현되는 GFP의 양을 증가시킨다는 점을 고려하여, 배양 준비를 위해 150 milliliters의 N NGM 완충액, 1.5 milliliters의 LB, 150 microliters의 1 molar 콜레스테롤 및 75 microliters의 100 milligrams per milliliter Streptomycin을 혼합하며 시작합니다. LB를 첨가하면 벌레가 유리 기구 및 플라스틱 기구에 달라붙는 것을 방지하는 데 도움이 되지만, 이 양으로는 박테리아의 성장을 지원하기에 충분하지 않습니다.

혼합물을 여과하여 멸균한 후, 멸균된 1 L 플라스크로 옮기고 GR 성체 웜에서 알이 배출될 수 있도록 플라스크를 그대로 둡니다. 웜을 원심 분리하고 상층액이 투명해질 때까지 NGM 배지를 교체하여 웜으로부터 박테리아를 세척합니다. 웜을 멸균수에 다시 현탁하여 원심 분리한 후, 한 번 더 세척합니다.

상층액을 제거하고 튜브에 3.75 milliliters의 멸균수를 채웁니다. 가정용 표백제 1 milliliter와 10 normal 수산화나트륨 250 microliters를 넣고 즉시 5~6회 도립 혼합합니다. 벌레들이 표백제에 4분 동안 노출된 후, 튜브를 로테이터에 놓습니다.

튜브를 실체 현미경 아래에 둡니다. 대부분의 성충은 용해되어 있어야 합니다. 튜브를 15~20회 강하게 흔들어 남은 성충들의 용해를 돕습니다. 총 5분 동안 용해가 진행된 후, 튜브가 가득 찰 때까지 멸균수를 추가합니다.

알을 수집하기 위해 5~6회 정도 전도 혼합합니다. 튜브를 500 RCF에서 1분 동안 원심분리합니다. 10 mL의 멸균수에 현탁하고 원심분리 후 상층액을 제거하는 방식으로 알을 3회 세척합니다.

다음으로, 100 µL의 알 샘플에 10 mL의 NGM 완충액을 첨가하여 100배 희석합니다. 그런 다음, 현미경 하에서 페트리 접시 뚜껑 위에 5 µL씩 세 번 분주합니다. 세 개의 별도 5 µL 분주액에 포함된 알의 수를 측정합니다.

전체 알의 수를 추정하기 위해, NGM 버퍼가 담긴 플라스크에 200,000개에서 200만 개의 알을 넣고 20°C에서 100 RPM으로 배양액을 흔들어 줍니다. 알을 플라스크에 넣은 후 최소 16시간이 지나면, 멸균된 세롤로지컬 피펫을 사용하여 현탁된 벌레 배양액 약 0.5 mL를 취합니다.

멸균된 페트리 접시 뚜껑 위에 5 µL 드롭을 세 번 피펫팅합니다. 벌레를 마비시키기 위해 뚜껑을 -20 °C 냉동고에 1~2분 동안 둡니다. 벌레가 마비되면 입체 현미경을 사용하여 5 µL당 부화한 살아있는 벌레의 평균 수를 세어 전체 수를 추정합니다.

이전에 준비한 냉동 OP 50 박테리아 배양액을 벤치 위에 몇 분간 두어 해동합니다. 그런 다음 부화한 벌레 500, 000마리당 50% OP 50 3 mL를 첨가합니다. 플라스크를 20 °C에서 100 RPM으로 흔들어 줍니다.

웜은 약 51시간 후에 L4 유충 및 청년 성체 단계로 발달합니다. 배양 기간 동안 육안 검사를 통해 박테리아 양을 모니터링하십시오. 배지가 투명해지면 박테리아를 더 추가하십시오.

멸균된 혈청 피펫을 사용하여 현탁된 벌레 배양액 약 0.5 milliliters를 표준 NGM 한천 배지에 옮깁니다. 실체 현미경으로 벌레를 관찰하여 대부분이 L4 유충 및 어린 성충인지 확인합니다. 명시야 현미경 하에서 L4 유충은 몸 중앙의 복부에 투명한 점이 보입니다. 어린 성충은 크기가 약간 더 크며 투명한 점이 없습니다.

다음으로, 벌레 배양액을 멸균된 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 튜브를 후드 내 시험관 랙에 놓고 부화하지 않은 알이나 발달하지 않은 벌레들이 가라앉도록 둡니다. 이들은 발달한 벌레보다 더 천천히 가라앉습니다.

10분 후, 부상액에 포함된 부화하지 않았거나 발달되지 않은 벌레들을 흡입 제거하고, 각 펠릿에 약 10 milliliters의 NGM buffer를 가한 뒤 튜브를 부드럽게 돌려 벌레들을 현탁시킵니다. 모든 벌레를 하나의 50 milliliter 튜브에 모읍니다. 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 500 RCF에서 30초 동안 원심분리합니다.

그 후 벌레를 1% LB가 함유된 NGM 50 milliliters에 다시 현탁하여 세척합니다. 세척 후 박테리아를 제거하기 위해 이 과정을 3~4회 반복합니다. 튜브에 LB 버퍼가 포함된 NGM을 50 milliliters까지 채웁니다.

이를 마그네틱 바가 들어있는 맞춤형 벌레 분주 플라스크에 붓고 교반기에 올립니다. 분주 플라스크와 분주 카세트의 데드 스페이스를 채우기 위해서는 최소 약 20 milliliters 또는 60,000마리의 벌레가 필요합니다. 이전에 설명한 대로 5 µL 방울 세 개의 벌레 수를 측정합니다.

5 µL 방울당 12~15마리의 농도가 되도록 NGM 및 LB에서 계수한 후, 84-웰 플레이트 한 장당 약 35,000마리의 벌레 또는 11.5 mL의 벌레 현탁액이 필요합니다. 10 µL 분주 카세트를 분주기에 장착하고 70% ethanol로 프라이밍하여 멸균합니다. 멸균수로 프라이밍하여 ethanol을 헹구어 냅니다.

분주 카세트의 끝부분을 플라스크에 넣어 교반자의 움직임을 방해하지 않으면서 바로 위에 위치하도록 합니다. 벌레들이 플라스크 전체에 계속 부유 상태로 유지되는지 확인하십시오. 분주기를 낮은 속도로 분주하도록 설정하고, 두 번의 프리 펄스 프라임(pre pulses prime) 후 최소 10 milliliters의 부유 벌레를 분주하도록 설정하십시오.

벌레가 튜브 내에 가라앉는 것을 방지하기 위해, 테스트 화합물이 이미 들어 있는 마이크로타이터 플레이트를 빠르게 채웁니다. 이때 이전에 마이크로타이터 플레이트에 로딩한 테스트 화합물이 필요합니다. 플레이트를 통기성 테이프로 밀봉하여 웰에 먼지가 쌓이는 것을 방지합니다.

분석에 적합한 온도로 설정된 인큐베이터 내의 쉐이킹 플랫폼 위에 플레이트를 놓습니다. 공기 흐름이 제한될 수 있으므로 플레이트를 겹쳐 쌓지 마십시오. 대상 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 넣고, 여기에 적절한 방출 및 들뜸 파장을 사용하여 각 웰의 형광 강도를 측정합니다.

GFP에 사용되는 필터는 들뜸 파장 485 nm 및 방출 파장 528 nm입니다. RFP에 사용되는 필터는 들뜸 파장 540 nm 및 방출 파장 590 nm입니다. 플레이트를 판독한 후, GFP와 RFP의 비율을 계산하고 활성 화합물이 포함되지 않은 대조군 웰의 판독값으로 정규화하여 각 처리군에서 유래한 형광 강도의 정확한 배수 차이를 결정합니다.

여기에서 보여주는 SSKN one 분석법은 염색체 통합 듀얼 리포터를 사용하며, 스테레오 현미경으로 벌레의 수를 수동으로 측정하였습니다. 벌레의 수는 분주된 부피와 R 제곱 값 0.94 및 p 값 0.0001 미만으로 상관관계가 있었습니다. 이는 각 웰에 분주되는 벌레의 수를 분주 부피를 조절함으로써 제어할 수 있음을 나타냅니다.

이 그림들에서 384웰 플레이트 전체의 웰 간 GFP 형광 총합(왼쪽)과 RFP 형광 총합(오른쪽)은 재현성이 매우 높게 나타납니다. X축은 각 웰에서 측정된 상대 형광값을 나타냅니다. 실선은 평균값을, 점선은 모든 웰의 평균 형광값에서 상하 3표준편차 범위를 나타내며, 변동 계수는 9% 미만이었습니다. 이 그림에 나타난 바와 같이, 384개 웰 전체에서 GST4 프로모터의 GFP 형광은 DOP3 프로모터의 RFP 형광과 선형 상관관계를 보이며, R² 값은 0.62, p값은 0.0001 미만입니다.

따라서, 비유도성 RFP 리포터를 사용하여 유도성 GFP 리포터를 표준화할 수 있습니다. 이렇게 하면 384-웰 플레이트의 웰 간 GFP 대 RFP 형광 비율이 매우 높은 재현성을 갖게 됩니다.

GFP와 RFP의 비율을 계산하면 변동 계수가 6% 미만으로 감소하여, 여기에서 보여주는 것과 같이 DOP three promoter RFP 리포터가 변동성을 줄일 수 있는 능력이 있음이 입증되었습니다. SK N one 활성 제노바이오틱(xenobiotic)에 의한 RFP 대비 GFP의 유도는 384-웰 플레이트 전반에 걸쳐 강력하고 재현성이 매우 높으며, 모든 대조군 및 due GLO 웰의 평균 상대 형광 비율은 실선으로 표시되어 있습니다. 대조군 평균의 +3 표준 편차와 dlo 평균의 -3 표준 편차는 점선으로 표시되어 있습니다.

일단 숙달되면, 웜 배양 시작은 1일 차에 약 1시간 정도 소요되며, 웜 수집 및 분배는 적절히 수행할 경우 약 2시간 정도 소요될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 최소 60,000마리의 웜으로 시작하고 분배하는 동안 웜이 부유 상태를 유지하도록 하는 것이 중요합니다. 본 절차에 따라 스크리닝을 진행하면, 예를 들어 다른 유도 경로에 대한 리포터 스트링(report strings) 분석을 수행하여 개발 이후 다른 경로의 조절제를 개발할 수 있습니다.

이 기술은 고속 스크리닝 및 바이오센싱 분야의 연구자들이 소분자 경로 조절제를 신속하게 식별하거나 환경 오염 물질을 검출하는 길을 열어줄 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 유도 가능한 전사 경로의 고속 스크리닝을 위해 형광 *E. coli* 균주를 배양, 분주 및 측정하는 방법이나 환경 오염 물질 검출을 위해 여러 샘플을 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.