성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

다음 실험의 전반적인 목적은 복잡한 장비나 기술 없이도 쥐 간 세포의 혼합 일차 배양물로부터 다수의 대식세포 배양물을 얻는 것입니다. 이는 먼저 콜라게나아제 관류를 통해 성체 쥐의 간 세포를 해리한 후, 실질 간세포 분획을 분리함으로써 이루어집니다. 그다음, 세포를 성장 배지가 담긴 T 75 조직 배양 플라스크에서 배양하여 간 세포의 혼합 일차 배양물을 수립합니다.

그 후 10~12일간 배양한 뒤, 배양 플라스크를 흔들어 대식세포를 플라스틱 접시로 옮깁니다. 이후 짧은 배양 기간 동안 선택적 접착을 통해 대식세포를 수확합니다. 최종적으로, 하나의 T 75 조직 배양 플라스크에서 2~3일 간격으로 2주 이상 반복해서 10개 이상의 6-cell을 수확할 수 있습니다. 간 대식세포의 분리 방법은 이미 잘 기술되어 있습니다.

하지만 기존의 대부분의 방법들은 원심분리기로 대표되는 정밀 장비와 숙련된 기술적 능력을 필요로 합니다. 본 영상에서는 특별한 장비나 고도의 실험실 기술 없이도 성체 쥐의 간 세포 혼합 일차 배양액으로부터 충분한 수와 순도의 간 대식세포를 얻을 수 있는 간단하고 새로운 방법을 제시합니다. 동물 해부, 간 관류 및 세포 준비 과정은 국립동물건강연구소의 Norco, Yamanaka, Miko yoshioka 박사가 시연할 예정입니다.

이어서 국립 농생명과학 연구소의 Taketo Takeno 박사가 배양 환경에서의 간 대식세포 분리 및 정제 방법을 보여주겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 쥐 간의 관류를 준비하기 위해, 세척액 한 병과 콜라게나제(collagenase) 용액 한 병을 미리 데워둡니다.

그 다음 피부 꼬집기 시험으로 진정 상태를 확인한 후, 마취된 성체 수컷 쥐를 스테인리스 팬에 놓고 복부와 흉부에 70% ethanol을 분무합니다. 이어서 해부 가위를 사용하여 복부 중앙에 작은 절개를 가하고 피부를 젖힙니다. 그 다음 가위로 복부를 절개하여 문맥의 위치를 확인합니다.

다음으로, 수술용 실을 문맥 아래로 통과시킨 후 느슨하게 묶습니다. 그 후, 간으로 혈액이 역류하는 것을 방지하기 위해 모스키토 클램프(mosquito clamp)로 하대정맥의 말단부와 장간막정맥을 집습니다. 가위로 횡격막을 절개하여 흉강을 열고, 안과용 가위로 문맥에 작은 절개창을 낸 후 심장을 노출시킵니다. 정맥에 2 mm 플라스틱 카테터를 삽입하고 카테터 주변의 실을 단단히 묶습니다.

사전 가온된 세척액을 퍼퓨전 시스템에 채운 후 카테터에 연결합니다. 분당 10 milliliters의 속도로 C two에서 퍼퓨전을 시작합니다. 동시에 해부 가위를 사용하여 우심방 벽을 절개합니다.

10분 동안 관류를 계속한 다음, 관류액을 콜라게나아제 용액으로 교체하여 10분에서 20분 동안 관류합니다. 분당 10mL의 속도로 멸균 비커에 콜라게나아제 용액 25mL를 채웁니다. 그다지 관류된 간을 꺼내어 비커에 조심스럽게 넣습니다.

가위로 간을 작은 조각으로 다집니다. 생성된 세포 현탁액에 75 milliliters의 차가운 MEM을 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅한 후, 100 micrometer 세포 스트레이너로 현탁액을 여과합니다.

소화되지 않은 조직 파편에서 결합 조직을 제거하려면 여과액을 50 milliliter conical tube에 수집하십시오. 여과액을 50 milliliter conical tube로 옮기고, 먼저 4 °C에서 50 Gs로 1분 동안 원심 분리하여 세포를 4회 세척하십시오. 원심 분리가 멈춘 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 차가운 MEM에 재현탁시키며, 마지막 세척 후 세포를 다시 원심 분리하십시오.

간 세포를 성장 배지에 다시 현탁합니다. 이제 세포를 6.7 × 10⁴ cells/cm²의 밀도로 5~10개의 T 75 조직 배양 플라스크에 분주합니다. 배양 플라스크를 인큐베이터에 넣고 2~3일마다 성장 배지를 교체합니다.

1일간의 배양 후, 실질 간세포는 플라스크 표면에 퍼지며 하나 또는 두 개의 둥근 핵을 가진 전형적인 다각형의 고팔스톤(copal stone) 모양의 형태를 보입니다. 배양 후 며칠 이내에 실질 간세포는 상피세포의 형태를 잃고 더 납작한 섬유아세포 모양의 세포로 변형됩니다. 6일째 무렵, 위상차 현미경 관찰 시 밝고 둥근 대식세포 유사 세포들이 섬유아세포 세포층 위에서 증식하기 시작합니다. 대식세포 유사 세포의 성장은 12일째 무렵 최대 수준에 도달합니다.

섬유아세포 세포 시트가 퇴행하기 시작하는 19일경에 대식세포 유사 세포의 수가 감소합니다. 따라서 배양 7~10일경에, 대식세포가 재현탁된 후 배양 플라스크를 30분 동안 상호 흔들어 세포 시트 위에서 증식한 대식세포를 배양액 내로 부유시킵니다. 100 밀리미터 비조직 배양 등급 플라스틱 디쉬 각각에 T 75 플라스크 2개분에서 얻은 배양액을 넣습니다.

배양 플라스크에 성장 배지를 다시 채우고 인큐베이터로 옮깁니다. 배양 기간 후 플라스틱 디시를 30분 동안 인큐베이션하고, 배지를 흡입하여 제거한 뒤 PBS로 플라스틱 디시를 부드럽게 헹구는 과정을 3회 반복하여 세척합니다. 여기에서 보시는 것처럼, 세포 도말 후 10분만 지나도 대식세포 유사 세포는 디시 표면에 부착되는 반면, 오염된 다른 섬유아세포들은 부유 상태로 유지됩니다. PBS 세척 후, 고도로 정제된 대식세포 집단을 얻을 수 있습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이, 세포들은 40분간의 배양 후 전형적인 대식세포 형태를 갖추게 되며, 화살표로 표시된 바와 같이 분열 중인 세포들이 빈번하게 관찰됩니다. 이렇게 새롭게 정제된 고순도의 대식세포 집단을 수집하려면, 세척된 세포에 1 mL의 Tryp LE Express 용액을 가하고 디쉬를 인큐베이터에 다시 넣어 10분 동안 추가로 배양합니다. 이 배양 기간이 끝나면 9 mL의 성장 배지를 추가하고, 셀 스크래퍼를 사용하여 부착된 대식세포를 부드럽게 긁어내어 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮긴 후 원심분리하여 상층액을 제거합니다.

성장 배지 1 mL를 첨가하고, 격렬하게 피펫팅하여 재현탁된 세포 뭉치를 단일 세포로 분리합니다. 이 그래프에 표시된 것처럼 혈구계수기로 세포 수를 측정하며, T 75 배양 플라스크에서 2~3일 간격으로 2주 이상 반복적으로 10^6개 이상의 세포를 수확할 수 있어, T 75 배양 플라스크당 총 10^7개의 세포 수율을 확보할 수 있습니다. 이 이미지들에서 볼 수 있듯이, 분리된 세포는 CD 68 또는 ED 1 및 CD 1 72 A 또는 OX 41과 같은 쥐 대식세포 항원에 대한 단일클론 항체로 면역 염색되었습니다. 이 세포들은 FITC 표지 마이크로비드의 활발한 식세포 작용과 같은 대식세포의 기능적 특성을 나타냈습니다.

본 영상에서는 성체 붉은 간 세포(red liver cells)의 혼합 일차 배양물로부터 대식세포를 얻는 간단하고 효율적인 방법을 제시하였습니다. 본 절차는 복잡한 장비나 기술을 필요로 하지 않으며, 동일한 배양물에서 반복적으로 수확 가능한 충분한 수의 순수 대식세포를 제공합니다. 이 방법은 다른 포유류 종에도 적용할 수 있습니다.

영상을 시청해 주셔서 감사하며, 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 감사합니다.