세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

본 절차의 전체적인 목적은 SI RNA 형질전환(Transfection)을 통해 DCS 내 표적 유전자의 발현을 억제(knock down)하는 것입니다. 이는 우선 AM Maxin Nucleo 이펙터를 프로그래밍함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 DCS와 siRNA를 함께 혼합한 후, 결과물인 세포 용액을 Nucleo QVE 모듈에 피펫팅하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 transfection 과정을 시작하기 위해 플레이트를 amaxa 셔틀 트레이에 넣는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 인터페론 반응을 활성화하기 위해 세포를 바이러스로 감염시키는 것입니다. 최종적으로, quantitative R-T-P-C-R 및 Western blotting을 통해 유전자 knockdown을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술은 수지상 세포의 신호 전달 경로를 특성화하는 데 유용하며, 수지상 세포 기반의 면역 요법 개발에 기여할 수 있습니다. DC 형질전환을 위한 Maxon 96 웰 셔틀 뉴클레오 팩터를 프로그래밍하려면 새 파라미터 파일을 여십시오. 96 웰 플레이트 도표에서 커서를 드래그하여 표준 형질전환에 사용할 웰의 수를 선택하십시오.

각 실험 샘플당 최소 3개의 웰을 풀링하여 사용하십시오. 이제 프로그램 코드의 파트 1에서 F, F를 선택하고 파트 2의 드롭다운 메뉴에서 1 68을 선택하십시오. 그다지 솔루션 박스에서 monocyte human을 선택한 다음, 컨트롤 옵션에서 standard를 선택하고 apply를 클릭하십시오.

트랜스펙션 미실시 대조군을 포함하려면, 다이어그램에서 추가 웰을 선택해야 합니다. 그런 다음 컨트롤 옵션에서 프로그램 미실시 컨트롤을 선택하고 다시 적용을 클릭하십시오. 뉴클레오펙션 용액을 혼합한 후, 실온까지 따뜻해지도록 둡니다.

필요한 수의 nucleo vete 모듈을 여기에 표시된 올바른 방향으로 nucleo VETE 플레이트에 배치합니다. 첫 번째 모듈을 1번 및 2번 행에 삽입한 후 나머지 모든 튜브에 대해 동일하게 진행합니다. 형질전환 시 웰당 500,000개의 세포가 되도록 세포 배양 플라스크에서 50 mL 튜브로 충분한 양의 DCS를 옮깁니다. 4 °C에서 400 G로 10분 동안 세포를 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 튜브에 nuclear affection 용액을 첨가하고 피펫으로 몇 번 부드럽게 위아래로 섞어 DCS를 재부유시킵니다.

이제 수행할 특정 처리에 따라 DPH 튜브에 라벨을 붙인 후, 재부유시킨 세포를 라벨이 붙은 튜브에 나누어 담습니다. 해당 epi endorf 튜브에 세포 500,000개당 최종 농도 0.25 µg이 되도록 SI RNA를 첨가하고, 피펫팅으로 세포 현탁액을 혼합합니다. 비표적 SI RNA를 사용하여 transfection이 이루어지지 않은 대조군 샘플을 준비합니다.

그런 다음, 이전에 프로그래밍된 실험 레이아웃에 따라 NucleoVet 모듈에 SI RA DC 세포 현탁액 20 µL를 피펫팅하고, 액체가 웰 바닥까지 도달하도록 합니다. NucleoVet 플레이트를 덮개로 덮고 단단한 표면에 몇 번 두드려 공기 방울을 제거하여 DC를 형질전환합니다. 준비된 NucleoVet 플레이트를 NucleoEffector 96-well 셔틀 트레이에 삽입합니다. 그런 다음 업로드 및 시작(upload and start) 버튼을 클릭합니다.

디스플레이에서 형질전환 과정의 진행 상황을 확인하십시오. 녹색 배경의 검은색 십자 표시는 해당 웰의 형질전환이 성공했음을 의미하며, 적색 배경의 검은색 막대는 세포 형질전환 중 실패했음을 의미합니다. 형질전환 과정이 완료되면 DC 성장 배지를 예열하고, 플레이트를 꺼내 각 웰에 예열된 DC 성장 배지 80 µL를 첨가하십시오.

멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 10분 동안 배양합니다. 배양 기간 동안, nucleo cuvette 플레이트 설정과 동일한 방향으로 matrix 튜브에 미리 데워둔 DC 성장 배지 100 µL를 첨가합니다. 배양 기간이 끝나면, nucleo CVE에 있는 세포 현탁액 100 µL 전체를 미리 준비된 matrix 튜브로 옮깁니다.

그 다음, 형질전환이 일어나지 않은 튜브들을 제거하여 폐기하십시오. 마지막으로, 매트릭스 튜브들을 24시간 또는 원하는 다른 시간 간격 동안 배양하십시오. 배양 중인 각 매트릭스 튜브에 맞게 einor 튜브에 라벨을 부착하십시오.

그 후 인큐베이터에서 매트릭스 튜브를 세포 배양 후드로 옮기고, 각 실험 샘플에 해당하는 매트릭스 튜브들을 미리 라벨링된 eend dfs에 모읍니다. 다음으로, 데스크탑 원심분리기를 사용하여 eend DPH 튜브를 10분 동안 400 G로 가볍게 회전시켜 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거한 후, MOI 1의 Newcastle disease virus 또는 NDV가 포함된 무혈청 성장 배지에 세포를 가볍게 재현탁합니다.

에피 엔도르핀(epi endorphins)을 멸균 상태로 덮은 후 튜브를 45분 동안 배양합니다. 이 배양 기간이 끝나면 900 µL의 DC 성장 배지를 추가하고 튜브를 다시 8~10시간 동안 배양합니다. 이는 형질전환 및 감염된 DC를 수확하기 위함입니다.

이전과 같이 데스크탑 원심분리기로 에이너 튜브를 회전시켜 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 단핵구 유래 수지상세포(DCs)에 RIG-I를 표적으로 하는 siRNA 또는 비특이적 glow siRNA를 transfection하고, 플러스(+) 표시와 같이 NDV를 감염시키거나 마이너스(-) 표시와 같이 감염시키지 않은 상태를 정량적 RT-PCR로 분석하였습니다. 전사 수준에서 RIG-I의 발현이 75% 감소한 것이 관찰되었으며, 인터페론 베타의 발현 또한 유사하게 감소하였습니다. 인터페론 신호 전달 폭포에서 RIG-I의 하위 작동체 또한 감소한 것이 관찰되었습니다. 또한, 감염되지 않은 대조군 transfection 세포에서는 인터페론 베타의 발현이 검출되지 않았습니다.

반면 MXA와 인터페론 베타 하위 반응 유전자의 반응은 미미했습니다. 여기서는 이전 그림과 동일하게 rigi 표적 irna를 사용하여 DCS를 2차 형질전환시킨 데이터가 이 실험에 제시되어 있습니다. 다만, 모든 세포에 NDV를 감염시켰으며, 절제되지 않은 단핵구 DCS를 사용한 추가 대조군이 포함되었습니다.

유전자 침묵 결과는 이전 그림에서 관찰된 결과와 유사했습니다. RGA를 탐침으로 한 웨스턴 블롯 결과, 해당 유전자의 단백질 발현이 완전히 차단되었음이 밝혀졌습니다. 1번과 2번 레인은 절제되지 않은 세포의 용해물 데이터를 보여줍니다.

3번과 4번 레인은 glow irna가 형질전환된 세포의 용해물을 나타내며, 5번과 6번 레인은 RIG I을 표적으로 하는 S Irna가 형질전환된 세포의 용해물을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 여러 유전자를 동시에 녹다운시키는 과정을 포함하여 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.