Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

6천만 명 이상의 사람들이 에이즈를 유발하는 바이러스인 HIV에 감염되었습니다. HIV/에이즈는 전 세계적인 보건 위기이며, 집중적인 연구 노력으로 감염자의 수명이 획기적으로 연장되었음에도 불구하고 진정한 백신은 여전히 개발되지 않은 상태입니다. HIV 백신 연구의 주요 초점은 HIV가 표적 세포로 침투하는 데 사용하는 엔벨로프 당단백질(envelope glycoprotein)입니다.

본 영상에서는 저온 전자 단층 촬영(cryo-electron tomography)이라는 이미징 기술을 사용하여 이 중요한 단백질의 구조를 얻는 방법을 시연합니다. 정제된 HIV를 시작으로, 동결 시료 준비 단계, 동결 시료로부터 전자 현미경 이미지를 기록하는 단계, 그리고 이러한 이미지를 HIV 에이즈 백신 설계에 유용하게 쓰일 수 있는 구조 모델로 변환하는 단계를 보여줍니다. 본 영상에서 제시하는 내용의 독특한 점은, 중고등학생부터 대학생 및 대학원생, 그리고 박사후 연구원과 선임 과학자에 이르기까지 다양한 연령대의 연구실 구성원들이 직접 작업을 시연한다는 것입니다.

크라이오 전자 토모그래피(cryo-electron tomography)에 적합한 유리화 바이러스 시료의 준비는 구리 그리드로 지지되는 탄소 필름의 작은 구멍들에 바이러스 수성 현탁액을 도포한 후, 바이러스를 급속 동결시켜 수행합니다. 이 단계의 목적은 거의 천연 상태로 포착된 온전한 바이러스의 동결 표본을 준비하는 것입니다. 먼저, 그리드를 글로우 방전 장치(glow discharge unit) 내부에 배치합니다.

이 장치는 그리드를 이온화된 가스에 노출시켜 세척합니다. 그리드를 사용할 준비가 되었으므로, 작은 금 입자와 혼합된 바이러스 현탁액을 준비합니다. 이 입자들은 데이터 수집 및 처리에 필수적입니다.

다음으로, 갓 플라스마 세척을 마친 그리드 위에 바이러스 현탁액 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 그리드를 로봇에 장착하면, 로봇이 여과지로 이를 닦아내어 액체 방울을 얇은 막 형태로 줄입니다. 이후 시료를 액체 에탄에 급속 침전시키면, 초당 100,000 kelvin 이상의 속도로 바이러스가 빠르게 동결됩니다.

급속 동결된 그리드를 보관함으로 옮겨 현미경으로 운반합니다. 원하는 수의 그리드가 동결될 때까지 이 과정을 반복합니다. 바이러스 샘플 그리드가 준비되었으므로, 다음 단계는 이를 현미경에 장착하는 것입니다.

이미징의 경우, 수동 또는 로봇 보조 방식으로 수행할 수 있습니다. 샘플 그리드를 수동으로 로드할 때, 사용자는 액체 질소 하에서 샘플을 조작할 수 있는 전용 스테이션에 앉아 샘플을 휴대용 질소 냉각 챔버에 넣고 밀봉 및 진공 처리한 후 현미경에 부착합니다. 최신 현미경은 더욱 자동화된 샘플 로딩 기능을 갖추고 있습니다.

여기 Titan Cryos 현미경에서는, 사용자가 냉동 시료를 현미경으로 전달하면 시료 그리드가 현미경 내로 로봇에 의해 로드됩니다. 이미징을 시작하기 전, 사용자가 각 그리드를 검사할 수 있습니다. 관심 있는 특징이 있는 시료 그리드의 각 영역에 대해 현미경 파라미터를 설정합니다.

이 사례에서 특징(feature)은 HIV 바이러스입니다. 새로운 영역이 각각 정의될 때마다 현미경 컴퓨터는 해당 영역의 특정 이미징 파라미터를 저장합니다. 사용자가 관심 있는 모든 위치를 정의하면, 컴퓨터가 각 위치를 자동으로 다시 방문하여 데이터 세트를 수집합니다.

각 데이터 세트는 전자빔이 그리드의 동일한 지점에 계속 초점이 맞춰져 있도록 유지하면서, 전자빔에 대해 샘플 그리드를 기울여 수집합니다. 전자 현미경의 데이터 수집은 전통적으로 사용자가 현미경 앞에 앉아 장비를 물리적으로 조작하는 방식을 요구해 왔습니다. 이러한 방식의 현미경 조작 모습이 오바마 대통령의 인텔 공장 방문 당시 장면에 나타나 있습니다.

최근 현미경 컴퓨터 인터페이스의 발전으로 이제 사용자는 실험실 내의 원격 컴퓨터나 외부에서 실시간으로 데이터 수집 상태를 모니터링하고 조정할 수 있게 되었습니다. 엔벨로프(envelope)의 형태와 당단백질 스파이크(glycoprotein spikes)를 시각화하기 위해서는 신호를 증폭시키기 위해 수백 장의 개별 이미지 정보를 평균화해야 합니다. 이는 계산 집약적인 과정으로, 여기서는 Bio Wolf라고 불리는 컴퓨터 클러스터를 사용하여 수행합니다.

NIH에서는 높은 노이즈 수준에서도 작동할 수 있는 알고리즘을 사용하여 개별 볼륨을 추출하고 정보를 평균화하는 강력한 방법들이 개발되었습니다. 이러한 유형의 데이터 특성상, 네이티브 바이러스 및 생물학적으로 중요한 분자와 복합체를 이룬 바이러스 모두에서 얻은 밀도 맵은 HIV의 구조 생물학에 대한 풍부한 정보 데이터베이스를 제공합니다. 이 데이터가 외피 당단백질 스파이크를 구성하는 개별 서브유닛의 X선 결정학 정보와 결합되면, 밀도 맵은 분자 수준의 세밀한 디테일로 구현됩니다.

이러한 토모그래피(tomo)에서 도출된 데이터는 매우 밀도가 높고 해석하기 어려울 수 있습니다. 엔터테인먼트 산업용 3D 소프트웨어를 사용하여 색상, 질감 및 조명을 추가함으로써 3D 모델을 시각화하면 분석이 더 용이해집니다. 일반적으로 사용되는 시각화 소프트웨어로는 Mirror 3D Studio Max와 Maya가 있습니다.

우리는 정제된 HIV에서 시작하여 엔벨로프 당단백질 구조의 분자 모델을 얻는 단계별 절차를 시연하였습니다. 이 방법을 통해 우리는 바이러스에 결합하고 이를 이용할 수 있는 다양한 분자들과 복합체를 이룬 엔벨로프 당단백질의 구조 또한 결정하였습니다.

여기에서는 B12라고 불리는 항체와 복합체를 이룬 외피 당단백질의 구조 사례를 보여줍니다. 어떤 분자는 바이러스에 결합하여 이를 활용할 수 있는 반면, 어떤 분자는 그렇지 않은 이유를 이해하는 것은 합리적인 백신 설계에 있어 매우 중요합니다. HIV 또는 인플루엔자 및 에볼라와 같은 다른 바이러스의 외피 당단백질 분자 구조를 결정하는 것은 바이러스의 진입과 활용을 이해하는 핵심입니다.

앞서 살펴보았듯이, 저온 전자 단층 촬영술(cryo-electron tomography)은 현재 이러한 목표를 달성하기 위한 강력한 도구로 부상하고 있습니다.