Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

한계 희석 세포 이식 분석법은 실험 동물 모델에서 자가 재생 능력을 평가하기 위한 표준 방법입니다. 본 시연에서는 단일 세포 단계의 동종 제브라피시 배아에 rag two MIC 및 RAG two GFP를 주입하여, 형광 표지된 T-세포 급성 림프구성 백혈병이 발생하는 형질전환 제브라피시를 제작합니다. 생후 60일이 되면 제브라피시로부터 일차 백혈병 세포를 분리한 후, 형광 활성 세포 분류법을 사용하여 이를 정제합니다.

다음으로, 세포를 성체 제브라피쉬의 복강 내에 한계 희석법으로 이식하고, 최대 90일 동안 물고기의 종양 성장 여부를 모니터링합니다. 마지막으로, 극소 한계 희석 분석 통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 원래 종양 내의 백혈병 증식 세포 빈도를 정량화합니다. 한계 희석 세포 이식 분석을 통해 연구자는 종양 덩어리 전체에 포함된 자기 복제 세포의 수를 정확하게 평가할 수 있습니다.

암 형성을 주도하고 궁극적으로 재발의 원인이 되는 것이 바로 이러한 자기 재생 세포들입니다. 제브라피쉬 모델에서 한계 희석 이식 분석(limiting dilution transplantation assays)을 수행하는 주요 장점은 실험마다 많은 수의 물고기에 이식할 수 있어, 자기 재생 종양 증식 세포의 빈도를 결정할 때 더 높은 정밀도를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 방법은 T-세포 급성 림프구성 백혈병의 종양 증식 세포에 대한 통찰을 제공합니다.

이는 다른 제브라피시 암 모델을 이해하는 데에도 적용될 수 있습니다. 연구실의 펠로우인 Jessica Blackburn과 숙련된 테크니션인 Sally Liu가 오늘 이 절차를 시연할 예정입니다. Rag2 CM 및 RAG2-GFP DNA 컨스트럭트를 선형화하기 위해, 각 플라스미드 10 µg을 제한 효소 NotI로 37 °C에서 하룻밤 동안 처리합니다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 후, 각 플라스미드를 20 µL의 물에 현탁합니다.

각각 소화된 플라스미드를 1:1, 1:5, 1:10으로 희석하고 20 µL, 10 µL, 5 µL의 high range DNA ladder와 함께 1% agro gel에서 전기영동하여 DNA 농도를 결정하십시오. 이제 CG one strain syngen에 주입하기 위해 DNA를 최종 농도 60 ng/µL로 희석하십시오. 제브라피시 배아에 30 ng/µL rag two CM 250 nL와 30 ng/µL를 주입하십시오.

DNA를 난황이 아닌 세포에 직접 정밀하게 표적하여 두 개의 GFP를 하나의 세포 단계 제브라피쉬 배아에 주입합니다. 주입된 배아를 28.5 °C에서 보관하고 24시간 후에 죽은 배아를 제거합니다. 생후 5일째에, 주입 후 약 28일이 지난 동물들을 대형 수조로 옮깁니다. 페트리 접시에 담긴 25 mL의 어류 시스템 워터에 4 ng/mL Tricaine을 200 µL 첨가하여 제브라피쉬 유생을 마취합니다.

에피 형광 현미경(epi fluorescence microscope)을 사용하여 GFP 형광을 검출함으로써 형광 표지된 TALL의 발달 여부를 유충에서 확인합니다. 분석 시 백혈병 물고기를 누락하지 않도록 종양 양성 유충을 음성 유충과 분리합니다. 음성 유충은 종양이 더 크게 성장할 수 있는 이후 시점에 다시 확인할 수 있습니다. 에피 형광 현미경을 사용하여 최소 일주일에 한 번 형광 표지된 백혈병 물고기를 관찰하여 종양 성장을 추적합니다.

GFP 양성 백혈병 세포가 동물의 50% 이상을 점유하면, 9mL의 어류 시스템 워터가 담긴 페트리 접시에 4ng/mL 농도의 Tricaine MS 1mL를 첨가하여 어류를 안락사시킵니다. 어류를 0.9X PBS에 희석된 5% fetal bovine serum 1mL가 담긴 새 페트리 접시에 옮긴 후, 면도날로 어류를 마쇄합니다. 혼합물을 파이펫팅하여 큰 세포 덩어리를 분리합니다. 그 다음, 세포를 40µm 메쉬 스트레이너를 통해 50mL 튜브로 걸러냅니다.

세포 500 µL를 4 mL 폴리스티렌 튜브에 피펫팅합니다. 사멸 세포를 염색하기 위해 1 mg/mL 농도의 peridium iodide 1 µL를 첨가하고 볼텍싱한 후, 세포를 얼음에 보관합니다. 또한, 종양 세포 이식 시 운반체 역할을 할 정상 혈액 세포를 수집하기 위해 야생형 CG1 물고기를 준비합니다. 50 mL 튜브에 0.9 X PBS 내 5% FPS 4 mL를 넣어 총 부피를 5 mL로 맞춥니다.

정상 혈구 세포를 0.9 x pbs 내 5%FBS에서 3 × 10⁵ cells/mL로 희석하여 농도를 맞춘 후, 형광 활성 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter)를 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100 µL씩 분주합니다. GFP 양성 및 PI 음성인 종양 세포를 지정된 용량으로 혈구 세포가 포함된 96웰 플레이트에 분류하여 넣습니다. 또한, 정상 혈구 세포가 없는 웰에 10,000 cells를 분류하여 넣고 FACS를 통해 분류된 세포의 순도와 생존율을 다시 분석합니다. 96웰 플레이트를 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

snat 95 µL를 제거하고 남은 5 µL에 세포를 재현탁합니다. 26.5 gauge 마이크로 시린지를 사용하여 60일 이상 된 성체 동계 zebrafish의 복강 내에 세포 현탁액을 주입합니다. 이식 전 zebrafish를 반드시 마취할 필요는 없습니다.

이식 후 약 28일째에 45마리의 물고기에는 10개의 백혈병 세포를, 20마리에는 100개의 세포를, 7마리에는 1000개의 세포를, 그리고 5마리에는 10,000개의 TALL 세포를 이식합니다. GFP 형광을 검출하기 위해 485-20 여기 파장과 530-25 방출 필터를 사용하는 형광 현미경으로 수여 제브라피쉬를 관찰합니다.

주입된 총 물고기 수 대비 양성 반응을 보인 물고기의 수를 기록합니다. 최대 90일까지 14일마다 물고기를 재검사하고 양성 반응을 보인 물고기의 수를 기록합니다. 종양 양성 물고기의 수가 더 많아지면.

Trica US 과량 투여로 동물을 희생시킨 후, 결과를 표에 입력하고 웹 기반의 극한 희석 분석 소프트웨어에 데이터를 업로드하여 일차 TALL CG one strain 배아에 RAG two cmic을 주입하여 자가 재생 백혈병 세포의 빈도를 결정합니다. RAG two GFP 유충을 대상으로 일차 TALL 여부를 스크리닝하였습니다. 이전 연구와 마찬가지로, 28일 후 주입된 물고기의 약 5%가 흉선 내에 GFP 양성 T 세포를 보유하며, 이러한 물고기의 100%가 백혈병으로 발전합니다. 본 실험에서는 65일 된 질환 동물로부터 형광 표지된 TALL 세포를 분리하여 한계 희석 세포 이식 분석에 사용하였습니다. 먼저, 단일 세포를 선택하기 위해 게이트를 설정하였습니다.

그 후 propidium iodide 음성 세포를 선택했습니다. 마지막으로 GFP 양성 백혈병 세포만을 선택하여 소팅하기 위해 게이트를 설정했습니다. TALL이 이식된 지 28일째 된 물고기의 이 사례에서, 초기 단계의 종양은 주입 부위 근처의 GFP 양성 세포 영역으로 관찰되었습니다.

일부 TLS는 더 많이 진행되어 이번 실험을 위해 복강을 가득 채울 정도로 확장되었으나, 220마리 이상의 동물에 이식되었으며, 이는 한 사람이 몇 시간 내에 쉽게 수행할 수 있는 작업입니다. elda 소프트웨어를 이용한 데이터 분석 결과, 평균적으로 135개의 T all 세포 중 하나가 자기 복제 능력을 갖춘 백혈병 증식 세포인 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 종양 세포를 동종 제브라피쉬의 복강에 한계 희석법으로 이식하는 방법과, 그 결과 데이터를 사용하여 주어진 종양 내의 종양 증식 세포 빈도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

유전자 변형 동물을 이용한 추가 연구를 통해 이러한 종양 증식 세포의 자기 재생을 조절하는 메커니즘을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.