사용하는 로컬 네트워크 처리를 검토 멀티 연락처 판상 전극 기록

본 절차의 전반적인 목표는 일차 시각 피질의 서로 다른 피질층에 있는 개별 뉴런과 국소 전위(local field potentials)가 감각 정보를 어떻게 부호화하는지 조사하기 위한 방법론을 설명하는 것입니다. 본 절차는 컴퓨터 제어 마이크로 드라이브 시스템의 구축 방법과 일차 시각 피질 내 기록을 위한 다접점 층판 전극(multi contact laminar electrode)의 사용법을 설명하는 것으로 시작합니다.

다음 단계는 전극을 목표 뇌 영역까지 진전시킨 후 유발 반응 전위 패러다임을 수행하는 것입니다. 이후 전류원 밀도 분석을 사용하여 극성 반전에 따른 피질층을 식별하며, 이때 동기화 소스 구성이 함께 이루어집니다. 절차의 마지막 단계는 수용장 매핑을 수행하고 시각 자극에 반응하는 신경 활동의 차이를 분석하는 것입니다.

궁극적으로, 감각 정보 인코딩의 층 특이적 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 휴스턴 텍사스 대학교 의과대학의 대학원생인 Sarah Eagleman입니다. 다중 전극 어레이와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, U-probe가 단 한 번의 삽입으로 피질의 수 밀리미터에 걸친 신경 활동을 동시에 기록할 수 있다는 점입니다.

안녕하세요, 제 이름은 Brian Hansen입니다. 저는 휴스턴 소재 텍사스 대학교 의과대학에서 공부하고 있는 대학원생입니다. 이 방법은 신경과학 분야의 핵심적인 질문에 답할 수 있으며, 정보가 층 특이적 방식으로 처리되는지 여부와 그 과정을 탐구합니다.

먼저 전극 구동 어셈블리를 제작하려면 가이드 튜브, 가이드 와이어, Dremel 완제품, 명명 도구 및 부품, 그리고 U 프로브를 포함하여 필요한 도구와 부품을 준비하십시오. 가이드 튜브를 측정하여 기록 장치에 부착했을 때 경막을 손상시키지 않고 그 위에 안착될 수 있을 만큼 충분한 길이를 확보하십시오. 다음으로, 기록 챔버의 깊이를 측정한 후, 가이드 튜브를 절단하면서 측정된 길이인 약 5~7 cm로 자릅니다.

금속 파편이 튜브 내부로 들어가지 않도록 주의하십시오. 가이드 튜브의 내경보다 작은 뻣뻣한 와이어를 사용하여 튜브 내부의 금속 파편을 제거하십시오. 그다음, 네임 그리드를 네임 베이스에 배치하십시오.

클램프 나사와 그리드 나사를 조입니다. 그런 다음 기록 관심 영역을 확인하고 해당 영역 위에 마이크로 드라이브 타워를 배치합니다. 관심 영역이 확인되면, 가이드 튜브가 챔버 바닥 외부로 약 1~2 mm 나올 때까지 그리드 하단으로 전진시킵니다.

다음으로, 각 NA 마이크로 드라이브 타워에 클램프 2개를 조립합니다. 모터가 상단 클램프를 구동하며, 하단 클램프는 고정하거나 느슨하게 둘 수 있습니다. 상단 클램프는 U 프로브의 보강 튜브에 부착됩니다.

가이드 튜브에 하단 클램프를 부착하고, 소량의 순간접착제를 사용하여 가이드 튜브를 고정합니다. 두 개의 클램프는 시스템에 안정성과 정밀도를 제공합니다. U 프로브의 팁을 가이드 튜브의 상단에 조심스럽게 맞춘 후, 타워를 메인 베이스에 고정할 수 있을 때까지 U 프로브를 가이드 튜브에 통과시킵니다.

U 프로브나 가이드 튜브에 추가적인 장력이 가해지지 않도록 썸스크류를 사용하여 타워 위치를 조정하십시오. 네임 시스템을 실린더 베이스 위에 놓고 모터 케이블을 해당 타워에 연결하십시오. 여러 개의 타워를 사용하는 경우, 색상별로 구분된 케이블 타이(zip ties)를 사용하여 모터 케이블과 타워를 구분할 수 있습니다. 네임 소프트웨어 프로그램을 사용하여 U 프로브를 전진시키십시오. 이는 대상 위치를 설정하여 U 프로브가 해당 위치까지 자동으로 전진하게 하거나, 네임 소프트웨어 인터페이스의 다운 버튼을 클릭하여 수행할 수 있습니다. U 프로브의 팁 끝부분이 가이드 튜브를 통과하여 네임 챔버의 끝단을 최소 10 millimeters 이상 지나치도록 전진시키십시오.

식립된 기록 챔버에 name base를 부착하기 전, U probe를 metro side 활성 알데히드 용액에 20~30분 동안 담가 멸균하십시오. 그 후, U probe와 name base를 멸균 증류수로 헹굽니다. name 소프트웨어에서 U probe의 팁이 가이드 튜브 바로 안쪽에 위치하도록 후퇴시켜 name 소프트웨어 위치를 잡으십시오.

모든 위치의 제로점을 클릭하십시오. 이름 베이스를 삽입된 기록 챔버에 부착하고 4개의 나사를 모두 조입니다. 그런 다음 기록 챔버 측면에 있는 핀에 맞춰 베이스를 정렬하십시오.

네 개의 나사를 다시 모두 조여 이름 베이스가 기록 챔버에 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 기록 진행을 준비하기 위해, 접지 및 기준 지침에 따라 U probe를 접지하고 플로팅 상태로 간주합니다. 이는 부착된 와이어 점퍼를 배치함으로써 수행됩니다.

하단 커넥터에서 헤드 스테이지를 U probe 커넥터에 고정하고, 앰플리파이어 케이블을 연결한 후 접지합니다. U probe를 처음에는 빠르고 강하게 약 1~2mm 정도 진입시킵니다. 속도 파라미터는 0.1~0.2 mm/s 범위로 설정하고, 깊이 단계(depth step)는 0.2~0.3 mm로 설정합니다.

이 값들은 U-probe가 경막을 깨끗하게 관통할 수 있도록 보장하며, 기록 단계에서 중요한 첫 번째 단계입니다. 경막을 통과한 후에는 속도를 0.50에서 0.1 millimeters per second로 줄이고, 깊이 단계를 0.5에서 0.1 millimeters로 줄이십시오. 목표는 조직 손상이 없도록 U-probe를 가능한 한 부드럽고 천천히 전진시키는 것입니다.

프로브가 뇌에 진입했다는 징후 중 하나는 LFP의 진폭 변화와 함께 노이즈 수준이 감소하는 것입니다. 전극이 모든 피질층에 걸쳐 있는지 확인하려면 전면 백색 섬광 자극에 반응하여 진폭의 변화를 측정하십시오. 시간에 따른 LFP 진폭의 변화는 유발 반응 전위 분석의 기초가 됩니다. 이 분석은 피질층을 식별하기 위한 근거를 제공합니다.

피험자에게 100 밀리초 동안 흰색으로 깜빡인 후 다시 검은색으로 돌아오는 전체 화면의 검은색 스크린을 노출시키면서 수동 고정 과제 중 유발 반응 전위를 측정합니다. 이 시퀀스가 1회의 시행을 구성하며, 총 200회 반복합니다. 다채널 획득 프로세서의 plex는 National Instruments PCI 보드를 통해 모든 연속 데이터 신호를 기록용 컴퓨터에 직접 저장합니다.

데이터를 저장한 후, 전류원 밀도 분석을 위한 신호 처리를 시작합니다. Plex에서 제공하는 FP align 소프트웨어 보정 기능을 사용하여 헤드 스테이지와 전증폭 보드의 필터로 인해 유발된 LFP 신호의 시간 지연을 보정합니다. 이 단계에서 데이터는 neuro explorer를 통해 MATLAB으로 전송됩니다.

각 LFP 채널은 컷오프 주파수가 0.5 hertz 및 100 hertz인 표준 고역 및 저역 통과 필터를 사용하여 필터링합니다. 각 전극 접촉 부위의 필터링이 완료되면, 각 트라이얼을 식별하고 트라이얼 간 평균을 내어 각 전극 접촉 부위의 평균 LFP 시계열을 얻습니다. 그런 다음 각 접촉 부위를 시간에 따른 LFP 진폭의 행렬로 구성하고, MATLAB 작업 공간에 CSD plotter를 입력하여 ICSD 툴박스를 실행합니다. 연속 데이터의 샘플링 주파수가 1 kilohertz이므로, DT 파라미터를 1 millisecond로 설정하십시오.

다음으로, 피질 전도도 값을 0.4 Siemens per meter로 설정합니다. 이는 nano peers per cubic millimeter 단위의 전류원 밀도(current source density)와 근사합니다. 그런 다음 전극 위치를 0.1부터 총 접촉 수인 1.6까지 0.1 간격의 벡터로 변경합니다. 모든 파라미터가 입력되면 실행(run) 버튼을 클릭합니다. CSD 플로터 인터페이스에서 CSD 프로파일을 확인하고 이를 새 그림에 붙여넣습니다.

이미지 SC와 같은 MATLAB의 일반적인 함수를 사용하여 층 프로파일을 도식화할 수 있으며, 다양한 평활화 알고리즘과 정규화 루틴을 적용하여 CSD 데이터를 표현하고 시간 및 세션 간의 층 식별 결과를 비교할 수 있습니다. 4층 하단에서 싱크-소스 구성과 함께 나타나는 극성 반전을 식별하려면, 먼저 과립층에 일차 싱크가 존재하는지 확인하십시오. 층상 CSD 프로파일을 사용하여 CSD 플롯에서 싱크로 인해 발생하는 음의 극성을 찾으십시오.

그 다음 입자 싱크(granular sink)의 질량 중심을 계산합니다. 접촉 수와 싱크가 가장 컸을 때의 시간을 포함하는 분석을 통해 OID를 얻습니다. syn Centro와의 접촉 지점은 0 µm에서의 입자층 기준으로 사용됩니다.

기준점 위아래의 모든 접점을 분석하여 세 가지 가능한 층 중 하나로 그룹화합니다. Supra, granular, infra granular 층은 전극 위치를 셔플링하여 시간 영역은 그대로 둔 채 granular sink를 검증합니다. 셔플링 후, CSD 행렬을 통해 OID 분석을 수행합니다.

다시 한번, 피질 깊이에 따라 전극 접촉점을 셔플링하면 층별 특이성이 사라져야 합니다. 수용장을 찾기 위해, 수용장이 위치할 가능성이 있는 모니터 영역에 역상관 자극을 제시하는 것부터 시작하십시오. 해당 자극은 45, 0, 90, 135도의 네 가지 방향 경사도로 구성됩니다.

수용장(receptive field)의 위치를 파악하기 위해 발화율 맵(firing rate maps)에 대해 군집 분석을 수행합니다. 먼저, 각 시간 지연(time delay)에 따른 최대 발화율 위치와 그 중심점(centroid)을 계산합니다. 그다음, 중심(Centro)과 이러한 최대 발화율 위치 사이의 거리를 계산합니다.

각 뉴런에 대해 독립적으로, 40에서 120 milliseconds 사이의 전도 지연을 5 millisecond 간격으로 설정하여 각 공간 위치에서의 발화율 맵을 계산합니다. 모든 시간 지연에 대해 OID와 주변 최대 발화율 지점 사이의 총 거리를 구합니다. 해당 거리를 최소화하는 시간 지연일 때가 수용 영역이 됩니다.

각 세포의 수용장(receptive field)을 찾으면, 기록된 세포군 내의 모든 수용장을 포함하고 모든 수용장 위치보다 더 큰 역상관 자극(reverse correlation stimulus)을 제시합니다. 실시간 발화율 그래프를 사용하여 정확한 수용장 위치가 식별되었는지 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 주성분 스파이크, 너비, 밸리(valley) 및 피크 특성과 같은 파라미터를 기반으로 파형 클러스터링을 수행하는 Plexon의 오프라인 소터 프로그램을 사용하여 스파이크 파형을 분류합니다.

반응이 갑자기 변하는 신호 단위를 반드시 제거하고, 여기에 제시된 추가 분석을 위해 발화율이 안정적인 단위만 유지하십시오. 시간에 따른 피질 깊이에서 피질층을 국소화하는 CSD 분석의 예를 살펴보면, 기록 세션이 시작된 지 4시간 후에도 super granular, granular 및 infra granular 층의 위치가 안정적으로 유지됩니다. CSD 트레이스는 해당 층으로 할당된 접촉점들의 평균을 나타냅니다.

이 예시에서 과립층은 약 50밀리초 지점에서 CSD 진폭의 뚜렷한 감소를 보입니다. 층판 전극을 사용할 때 수행해야 할 또 다른 중요한 분석은 뉴런 수용장의 위치를 정확하게 식별하고 국소화하는 것입니다. 이 그래프들의 원점은 검은색 컴퓨터 화면 중앙에 표시된 작은 흰색 원인 고정점입니다.

이 그래프의 색상은 동적 역상관 자극에 반응하는 각 뉴런의 발화율을 나타냅니다. 이 그림은 동일한 채널에서 분리된 스파이크 파형의 두 가지 예시를 보여줍니다. 클러스터 분석은 주성분 분석 및 스파이크 파형 특성을 사용하여 수행되었습니다.

평균 스파이크 파형은 실선으로 표시되어 있습니다. 표준 편차는 점선으로 표시되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 전극을 조심스럽게 전진시키고, 전진 후 뇌가 충분히 안정될 수 있도록 충분한 시간을 갖는 것이 중요합니다.

일반적으로 이 절차에 따른 마지막 전진 후 약 30분에서 45분 뒤에 기록을 시작합니다. LFP 파워 및 스파이크 필드 동기화(Spike Field synchronization)와 같은 다른 스펙트럼 기법을 사용하여 피질층 내부 및 층 간의 네트워크 구조를 연구할 수 있습니다.