CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 갓 채취한 마우스 조직에서 적혈구 전구세포를 직접 식별하는 것입니다. 이를 통해 마우스의 조혈 시스템이 변화하는 시기에 이들 세포의 분자적 특성을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 배아 발달 과정이나 저산소 스트레스에 대한 반응 중에 마우스의 태아 간, 성체 비장 또는 골수에서 먼저 조혈 조직을 분리한 후 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.

다음으로 세포 표면 마커인 CD 71 및 TER 119에 대한 항체와 세포 생존율 또는 세포 주기 상태 측정 등 관심 있는 다른 마커들을 사용하여 세포를 라벨링합니다. 이후 라벨링된 세포 현탁액을 유세포 분석기로 분석하여 성숙 단계가 서로 다른 특정 적아세포 서브셋을 식별합니다. 이러한 특정 서브셋은 세포 분리를 통해 정제할 수 있습니다. 그 후, 각 적아세포 성숙 서브셋에 대해 세포 및 분자 분석을 수행할 수 있습니다.

갓 분리한 조혈 조직 내에서 특정 성숙 단계의 적혈모구를 직접 식별할 수 있는 능력은 생리적 피질 내의 세포를 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 이 방법은 서로 다른 성숙 단계의 고단계 적혈모구가 생체 내(in vivo)에서 어떻게 반응하는지 연구할 수 있게 합니다. 생쥐가 자극을 받으면 적혈구 생성 속도가 가속화됩니다.

예를 들어, 고산 지대를 모사한 저산소 조건이나 에리스로포이에틴(erythropoietin) 호르몬의 주입 등이 있습니다. 당사는 다중 파라미터 유세포 분석법을 사용하여 복잡한 조직 환경 내에서 적아세포(erythroblasts)를 식별하고, 이들의 신호 전달, 생존 및 세포 주기 상태를 동시에 연구합니다. 또한 신선한 조직에서 특정 성숙 단계의 적아세포를 직접 분리하여 유전자 발현 수준, 염색질 상태 또는 기타 분자적 기능을 탐색할 수 있습니다.

마우스의 확정적 적혈구 생성은 성체 마우스의 비장과 골수에서 일어납니다. 따라서 안락사시킨 마우스로부터 이 조직들을 채취합니다. 마우스를 안락사시킨 후 심장 천자를 통해 EDTA 또는 헤파린 혈액 수집 튜브에 혈액을 채취하며, 이 혈액은 추후 헤마토크릿 수치, 망상적혈구 수치 또는 CBC 분석에 사용됩니다.

수확한 비장과 대퇴골을 각각 차가운 염색 완충액(staining Buffer)이 들어 있는 별도의 튜브에 넣습니다. 필요한 경우 수확한 조직을 얼음 위에 보관하십시오. 비장의 무게를 측정합니다.

적혈구 생성 스트레스 반응을 겪는 마우스는 비장 무게가 유의미하게 증가하는 경향을 보입니다. 이후, 마우스 배아에서 이전에 입증된 절차에 따라 수확한 조직으로부터 비장 세포와 골수 세포를 준비합니다. 확정적 적혈구 생성은 배아기 12.5일에서 15.5일 사이에 태아 간에서 일어납니다.

임신 12.5~14.5일째의 시기 조절 임신 암컷 마우스를 준비하여 태아 간 세포를 얻습니다. 시기 조절 임신 암컷 마우스를 안락사시킨 후 자궁각을 얼음이 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 차가운 배양 배지 또는 염색 완충액을 사용합니다.

배아 12.5일 또는 그 이전 단계의 태아 간을 해부하여 자궁에서 배아를 적출하려면 해부 현미경이 필요합니다. 먼저 각 배아를 자궁각에서 분리합니다. 그런 다음 자궁벽을 조심스럽게 절개하여 양막낭 안에 있는 배아를 꺼냅니다.

양막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 태아의 간은 훨씬 작은 심장 아래에 위치한 가장 큰 붉은색 복부 조직입니다. 태아의 간을 적출하려면, 핀셋을 사용하여 간의 양옆에서 배아를 고정한 뒤 간을 복부 밖으로 밀어내어 배지로 옮깁니다.

간을 신선한 염색 완충액이 담긴 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 모든 태아 간의 박리 및 신선한 염색 완충액 튜브로의 이동이 완료되면, 피펫팅을 통해 간을 기계적으로 해리한 후 해리된 세포를 40 micron 나일론 메쉬 스크린으로 여과합니다. 원심분리를 통해 세포를 두 번 세척하며, 이때 상층액은 제거하고 염색 완충액으로 다시 현탁합니다.

두 번째 세척 후, 세포를 trypan blue로 염색하고 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 수를 셉니다. E 13.5의 태아 간에는 약 10⁷개의 세포가 있습니다. 유세포 분석을 위해 세포를 200 µL 샘플당 1~2 × 10⁶개의 세포 농도로 재부유시킵니다.

본 비디오 프로토콜에서는 유세포 분석을 위한 항체 염색 과정을 태아 간세포만을 대상으로 하여 시연합니다. 이 절차를 시작하기 위해, 마우스 세포의 FC 수용체를 차단하기 위한 정제된 rabbit IgG, CD 71 FETR one 19 PE 및 세포 표면 단백질 fast를 표적으로 하는 항체를 포함하는 1차 항체 염색 프리믹스를 준비합니다. 튜브를 2~3회 반전시켜 항체 용액을 부드럽게 혼합한 후, 이전에 준비한 태아 간세포 샘플에 1차 항체 염색 프리믹스 200 µL를 첨가하고 피펫팅을 부드럽게 수행하여 세포를 재부유시킵니다.

다음으로, 6개의 대조군 세포 샘플을 준비하십시오. 세포의 배경 자가형광을 확인하기 위해 염색 완충액에 그대로 둔 미염색 샘플, 채널 간의 스펙트럼 중첩을 보정하기 위해 프로토콜에 사용된 각 항체 또는 색상별 단일 색상 샘플(본 실험에서는 TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotin 및 streptavidin A PC), 그리고 fast biotin의 실제 배경값을 제공하기 위해 fast biotin을 제외한 프로토콜 내의 모든 색상 또는 항체로 염색한 seven A A DA fluorescence minus one 대조군 샘플이 필요합니다. 샘플과 관련 대조군을 1차 항체 염색액에 넣고 얼음 위 암소에서 45분에서 1시간 동안 배양하십시오.

배양 단계가 끝나면, 각 시료 튜브에 염색 버퍼 3 mL를 추가하여 세포를 세척하고 4 °C에서 약 400 ×g로 3~5분 동안 원심 분리합니다. 그다음, PC에 strep avid를 처리하고 튜브를 얼음 위에서 30~45분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 첫 번째 항체 염색 때와 동일하게 세포를 세척합니다.

마지막으로, 사멸 세포를 제외하기 위해 세포 투과성 없는 DNA 염색약인 seven a a d가 포함된 염색 용액에 세포를 재현탁합니다. 이제 샘플을 유세포 분석에 사용할 준비가 되었습니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 유세포 분석 이벤트의 정확한 게이팅 분석을 통해 적아구 하위 집단을 신뢰성 있게 식별하는 것입니다.

이를 위해서는 정밀한 기기 설정, 적절한 대조군 샘플 준비, 스펙트럼 중첩에 대한 세심한 보정, 그리고 이후 사멸 세포, 응집체 및 매우 작은 이벤트들을 제외하는 게이팅 과정이 필요합니다. 데이터 분석 시작 단계에서, 염색되지 않은 샘플과 단일 색상 대조군 샘플을 사용하여 각 색상 조합에 대한 스펙트럼 중첩 보정을 설정합니다.

이 예제에서는 FITC 형광이 PE 채널로 얼마나 유입되는지, 그리고 보정(compensation) 후에 이러한 스펙트럼 중첩이 어떻게 교정되는지 보여드리겠습니다. 먼저, 비염색 대조군을 사용하여 FITC 양성 및 PE 음성 영역을 정의합니다. 다음으로, FITC 단일 색상 대조군을 사용하여 PE 채널로의 스펙트럼 유입을 시각화할 수 있습니다.

FlowJo 소프트웨어를 이용한 디지털 보정 후, PE 채널의 spillover fit E 신호를 최소화합니다. 보정이 완료되면 사멸 세포, 응집체 및 작은 이벤트를 제거할 수 있습니다. 응집체와 세포 이중체(doublet)는 forward scatter height와 forward scatter area를 플로팅하고 좁은 대각선 게이트 내의 이벤트를 선택하여 제거합니다.

dapi 세포 투과 불가 DNA 염색약에 대해 음성인 세포를 선택하여 사멸 세포를 제거합니다. DAPI 음성 생존 세포 게이트는 전방 산란광이 매우 낮은 핵이나 데브리(debris)와 같은 매우 작은 이벤트들도 함께 제외합니다. 다음으로, 태아 간 세포의 게이팅 전략을 보여드리겠습니다.

갓 수확한 세포를 CD 71 TUR one 19 및 비적혈구 계통 마커를 표적으로 하는 ZI 표지 항체 칵테일로 표지하였습니다. 본 예시에서는 샘플의 스펙트럼 중첩에 대한 보정이 이미 완료되었으며, 응집체, 사멸 세포 및 매우 작은 이벤트를 제외하도록 게이팅이 수행된 상태입니다. 계통 양성 fitzy 염색을 제외한 모든 색상이 포함된 FMO 샘플을 사용하여 fitzy 히스토그램을 그리고 계통 음성 세포 게이트를 정의합니다. 다음으로, 이 게이트를 ZI 결합 계통 마커로 염색한 태아 간 세포 샘플에 적용합니다.

Lineage 음성 세포를 선택하여 Y축에는 CD 71을, X축에는 TER 19를 표시하여 도식화합니다. 이제 X축을 기준으로 세포를 S zero에서 S five까지의 하위 집단으로 나눌 준비가 되었습니다. Lin 제거된 S zero 하위 집단은 주로 EPO 의존성이 시작되기 전의 CFUE 잠재력을 가진 세포들로 구성됩니다.

S one 서브셋은 주로 세포 주기의 S기에 있는 EPO 의존성 CFUE 세포를 포함합니다. S two 서브셋 세포는 콜로니 형성 능력을 상실하고 헤모글로빈을 발현하기 시작하며, S3 서브셋 세포는 주로 호염기성 적아세포입니다. S four 및 S five 서브셋은 후기 적아세포를 포함합니다. 여기에는 CD 71 및 TER one 19 표적 항체로 처리 및 라벨링된 비장 세포와 사망 수용체 fast 히스토그램으로부터 데이터를 획득한 후의 분석 전략이 나와 있습니다.

하나는 획득된 모든 이벤트를 보여주며, 여기서 대각선 게이트는 더블렛이나 더 큰 응집체를 제외하고 단일 세포일 가능성이 높은 이벤트를 나타냅니다. 이 게이트 내의 세포들은 여기의 두 번째 히스토그램에서 추가로 분석됩니다. 핵 또는 데브리스일 가능성이 높은 매우 작은 이벤트들은 제외됩니다.

게이팅된 세포들은 히스토그램 3에 표시되어 있으며, 여기에서 막 투과성이 있는 세포사멸 세포일 가능성이 높은 DAPI 양성 세포들은 추가 분석에서 제외됩니다. 히스토그램 4는 그 결과로 얻어진 생존 비장 세포 집단을 보여줍니다. pro eGate에는 CD 71 high TER one 19 Intermediate 세포들이 포함되어 있으며, tur R one 19 high 세포들은 히스토그램 5에서 추가로 분석됩니다.

여기서 CD 71 고발현 세포는 덜 성숙한 넓은 영역인 a 적아구와 더 작고 더 성숙한 A B 적아구로 세분됩니다. 가장 성숙한 적아구 하위 집단은 ARI C입니다. TER R one 19 및 CD 71과 동시에 관련 항체를 추가함으로써 이러한 각 하위 집단에 대한 세포 표면 단백질의 발현을 동시에 측정할 수 있습니다. 염색 히스토그램 6은 기저 상태의 생쥐와 E ppo를 단회 투여한 생쥐에서 특히 area, A 하위 집단의 세포 표면 사멸 수용체 fast 발현을 보여줍니다.

결과는 EPO가 해당 영역에서 fast 발현을 억제한다는 것을 나타냅니다. 각 서브셋에 속한 세포들에 대해 세포 내 단백질의 in vivo 발현군이나 세포 주기 상태를 측정할 수도 있습니다. 이 대표적인 세포 주기 분석에서는 마우스의 복강 내에 BRDU를 주입하고 30분에서 60분 후에 골수를 채취하였습니다.

CD 71 및 TER one 19 염색 외에도, 복제 중인 DNA로의 BRDU 통합 여부를 확인하기 위해 세포를 염색하였습니다. BRDU 양성 세포는 세포 주기의 S-phase에 해당합니다. Interface 세포는 BRDU 음성이며 G one 또는 G two M phase로 구분될 수 있습니다. DNAD seven A A D를 사용하여 PRO E area A A B 및 A EC 서브셋 각각에서 세포를 분리할 수 있습니다.

여기서는 세포 크기의 감소, 핵 응축, 그리고 헤모글로빈 발현을 반영하는 갈색 착색의 증가와 함께 순차적인 성숙 과정을 보여주는 사이토신 표본들이 제시되어 있습니다. 마지막으로, E 13.5 태아 간의 S3 하위 집단에 대한 대표적인 세포 주기 분석 결과가 여기에 나타나 있습니다. 임신한 마우스에 BrdU를 주입하였습니다.

태아 간을 적출하고 30~60분 후에 고정 및 투과화 처리한 다음, CD 71, TER one 19 및 BRDU에 대한 항체로 염색하였습니다. S-phase 세포가 BRDU 양성인 것을 통해 S3 세포의 세포 주기 상태를 분석하였으며, DNA 염색약인 seven A a d로 염색하여 DNA 함량을 정량화하였습니다.

본 연구에서 설명하는 사이토메트리 접근법을 이용하면 세포 표면 마커 및 기타 단백질의 발현, 특정 인산화 항체를 이용한 세포 생존 및 세포 신호 전달, 그리고 세포 주기 상태와 같은 세포 기능을 동시에 조사할 수 있습니다. 따라서 이를 통해 다양한 자극에 대한 적혈구모세포(erythroblast)라는 서로 다른 성숙 단계의 분자적 반응이나 유전적 변이의 영향을 조사할 수 있습니다. 유세포 분석을 통한 성숙 하위 집단은 세포 표면 마커의 발현과 전방 산란광(forward scatter)을 기준으로 정의된다는 점에 유의해야 합니다.

일반적으로 각 서브셋의 세포들은 다양한 마우스 모델에서 유사한 형태학적 적혈모구 단계에 해당한다는 것을 확인했습니다. 하지만 새로운 마우스 모델을 조사할 때는 이를 검증하는 것을 권장합니다. 각 서브셋의 세포를 분리하여 형태를 관찰함으로써 이를 확인할 수 있습니다. 또한, 각 서브셋의 세포를 분리하여 RNA 또는 전사체 분석에 사용할 수 있는데, 분리 실험 시 세포에 가해지는 전단 응력을 최소화하기 위해 낮은 분리 압력과 넓은 노즐을 사용하십시오.

또한 각 소팅 실험 후에 세포 순도와 생존율을 확인하는 것을 권장합니다. 마지막으로, 특정 서브셋의 빈도 변화를 감지했을 때, 이것이 해당 서브셋 내 세포 수의 실제 변화로 인한 것인지 아니면 다른 서브셋의 변화로 인한 것인지 판단하는 것이 중요합니다. 따라서 서브셋 빈도를 측정하는 것 외에도, 각 서브셋의 절대 세포 수를 항상 함께 측정해야 합니다.